Диссертация (1145685), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА вмасштабе пилотного промышленного производстваДальнейшеемасштабированиетехнологииполученияИЛ-36РАпроведеноприкультивировании штамма-продуцента в масштабе пилотного промышленного производства(биореактор 250 л, объём культуры 160 л). Описанная выше технология очистки ИЛ-36РА,включающая флоккуляцию и негативную анионообменную хроматографию на сорбенте QSepharose Fast Flow (GE, США), оказалась неудобна для дальнейшего масштабирования.Поэтому был разработан метод очистки ИЛ-36РА на сорбенте SP Sepharose Fast Flow (GE,США).4.2.3.1.Оптимизация метода кислотного фракционирования лизата биомассыштамма-продуцента ИЛ-36РАДля оптимизации метода пробоподготовки перед очисткой ИЛ-36РА на сорбенте SPSepharose Fast Flow (GE, США), сначала определили параметры хроматографическойсистемы.Поскольку наиболее значимым параметром для эффективности сорбции раствора насорбент SP Sepharose Fast Flow (GE, США) является значение рН, был проведен рядэкспериментов,где,принявзаконстантуионнуюсилураствораипараметрыхроматографической системы, варьировали только значение рН.
Выяснили, что оптимальнымявляется значение рН 4,0-4,1. При увеличении рН эффективность сорбции снижается и при рН4,4 сорбция не происходит вообще. При рН менее 4,0 эффективность сорбции не увеличивается.Поэтому далее лизат биомассы наносили на сорбент при рН 4,0.На ранних этапах работы от применения катионнообменной хроматографии отказались,т.к. потери ИЛ-36РА при закислении лизата составляли около 50%. Тогда биомассу лизировалитрёхкратным замораживанием и оттаиванием. На этом этапе пробоподготовку лизатапроводили иначе.114Биомассу заморозили и разморозили один раз, ресуспендировали в 50 мМ трисацетатном буфере, рН 7,0, перемешивали 30 минут, затем добавляли 50% уксусную кислоту дополучения рН 4,0.
Осадок удалили центрифугированием. Потери ИЛ-36РА при таком методесоставили в среднем 39%.Очевидно, что потери ИЛ-36РА происходили за счёт агрегации при переходе черезизоточку pI 5,2. Поскольку центрами агрегации могли служить частицы клеточного дебриса,взвешенные в растворе, к протоколу был добавлен шаг осветления первичного лизатацентрифугированием перед закислением. Это позволило снизить потери ИЛ-36РА в среднем до31%.Добавление в раствор детергентов (0,1-1% Triton X-100, 0,1-1% Triton X-114, 0,1-1%Tween-80) и цвиттерионов (0,1-1% таурин или бетаин) не принесло никакого значимогорезультата. Не уменьшили потерь ИЛ-36РА также длительное перемешивание раствора,двукратное его разбавление перед закислением, более медленное закисление, использование25% уксусной кислоты, а также использование формиатной буферной системы.Получаемый раствор содержал значительно меньше примесных белков (Рисунок 53), ненуждался в дальнейшем осветлении и был пригоден к нанесению на сорбент (Рисунок 54).12345МВ, кДаРисунок 53.
Элетрофореграмма образца лизата биомассы ИЛ-36РА на разных этапахобработки. Дорожки: 1 – лизат до осветления; 2 – лизат после закисления уксусной кислотой,надосадочная фракция; 3 – лизат после закисления уксусной кислотой, осадок; 4 – лизат послезакисления муравьиной кислотой, надосадочная фракция; 5 – лизат после закислениямуравьиной кислотой, отмытый осадок.115АБВГРисунок 54. Фотографии образца лизата биомассы ИЛ-36РА на разных этапах лизиса. А– лизис 50 мМ трис-ацетатным буфером, до осветления, Б – после осветления, В – послезакисления, Г – после финального центрифугирования.Таким образом, был оптимизирован протокол получения лизата биомассы штаммапродуцента ИЛ-36РА с рН 4,0, пригодного для нанесения на хроматографический сорбент.4.2.3.2.ОптимизацияметодаочисткиИЛ-36РАсприменениемкатионообменной хроматографииРанее было обнаружено, что ИЛ-36РА полностью сорбируется на сорбент SP SepharoseFast Flow (GE, США) при нанесении в 50 мМ трис-ацетатном буфере рН 4,0.
Далее требовалосьоптимизировать условия элюции ИЛ-36РА таким образом, чтобы с одной стороны получитьмаксимально чистый ИЛ-36РА с минимальными потерями, и с другой стороны сделать методмасштабируемым. Кроме того, этот метод решили оптимизировать сразу для применения в116стандартных условиях при + 4-8 °С в холодильных шкафах для уменьшения рискаконтаминации ЛПС.В ряде экспериментов выяснили, что ИЛ-36РА эффективно элюируется 0,4 М NaCl в 50мМ трис-ацетатном буфере рН 4,0.
При этом около 30% ИЛ-36РА элюировалась также припромывке сорбента 2 М NaCl в том же буфере. Около 30% ИЛ-36РА элюировалось прирегенерации сорбента 0,2 М NaOH (Рисунок 55).МВ, кДа1234567Рисунок 55. Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографическойочистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте SP Sepharose Fast Flow(GE, США) при элюции различными концентрациями NaCl.
Дорожки: 1 – исходный лизат, рН7,0, 2 – осадок после закисления лизата, 3 – лизат рН 4,0, 4 – несвязавшаяся фракция, 5 –элюат0,4М NaCl, 6 –промывка 2 М NaCl,7 – регенерация 0,2 М NaOH.Изменение условий проведения хроматографической очистки (двуступенчатая элюциябуферами с разными значениями рН (5,5 и 7,0) и регенерация 0,2 М NaOH) не улучшилополученный результат (Рисунок 56). Однако это позволило избежать перехода белка через егоизоточку рН 5,2 при подготовке ко второму этапу хроматографической очистки.11712345МВ, кДаРисунок 56. Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографическойочистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте SP Sepharose Fast Flow(GE, США) при элюции растворами с различными рН.
Дорожки: 1 – лизат рН 4,0; 2 –несвязавшаяся фракция; 3 – элюат рН 5,5; 4 – элюат рН 7,0; 5 – регенерация 0,2 М NaOH.Предположив, что фракция ИЛ-36РА, которая обладает повышенной сорбционнойспособностью, состоит из частично денатурированных или неправильно упакованных молекул,был проведен ряд экспериментов по ренатурации ИЛ-36РА, получаемогона этапе лизисабиомассы.Лизаты с рН 7,0 или рН 4,0 без добавок либо с добавлением 1 мМ бета-меркаптоэтанола,либо 0,1% Tween-80, либо обеих добавок сразу инкубировали при + 4 °С в течение 1, 3, 7 и 14дней.
После этого проводили хроматографическую очистку образцов на сорбенте SP SepharoseFast Flow (GE, США) по методике с элюцией ИЛ-36РА растворами с рН 5,5, рН 7,0 и 0,2 МNaOH. Сравнивали процентное соотношение ИЛ-36РА, элюировавшегося различнымирастворами. В случае рефолдинга при рН 4,0 никаких изменений не произошло. В случаерефолдинга при рН 7,0 при увеличении времени инкубации возрастала доля ИЛ-36РА,элюирующегося при рН 5,5. Она достигала максимума к 14 дню, составив 88% (Рисунок 57).При этом доля целевого белка, смываемого при рН 7,0 и регенерации колонки, снизилась до 8%и 0%, соответственно. Добавки не внесли какого-либо значимого вклада в эффективностьрефолдинга.118Рисунок 57.
Сравнение относительного количества ИЛ-36РА, элюировавшегося ссорбента SP Sepharose Fast Flow (GE, США) при элюции растворами с рН 5,5, рН 7,0 и 0,2 МNaOH после рефолдинга различной длительности. Концентрации ИЛ-36РА в образцахопределены методом ИФА.Таким образом, удалось существенно уменьшить потери при хроматографическойочистке на сорбенте SP Sepharose Fast Flow (GE, США). Чистота ИЛ-36РА, получаемого приэлюции раствором рН 5,5 составляла в среднем 84% (Рисунок 58).
Чистота ИЛ-36РА,получаемого при элюции раствором рН 7,0 составляла в среднем 12% (Рисунок 58). Окисленнаяформа ИЛ-36РА в процессе очитки не образуется.Однако получаемый на этом этапе ИЛ-36РА содержал в среднем 160 EU ЛПС на мг ИЛ36РА. Поскольку с хроматографическим сорбентом эффективно связывался ИЛ-36РА, а неЛПС, то для удаления последнего ввели дополнительные промывки растворов детергентов,таких, как Triton X-100 или Triton X-114.Сорбент с иммобилизованным ИЛ-36РА промывали 10 объёмами 1% растворов этихдетергентов, затем 10 объёмами % раствора Tween-80 для удаления остаточных количеств этихдетергентов и 10 объёмами обычного отмывочного раствора.
В результате отмывок обоимидетергентами был достигнут одинаковый результат: при элюции был получен ИЛ-36РА ссодержанием ЛПС 2-4 EU/мг белка. Triton X-100 и Triton X-114 не были обнаружены в образцепосле анализа методом ОФ-ВЭЖХ. Снижение объемов растворов детергентов снизилоэффективность удаления ЛПС.1191Рисунок58.234Типичная56МВ, кДаэлектрофореграммафракций,полученныхпослехроматографической очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте SPSepharose Fast Flow (GE, США) с элюцией растворами с различными рН, после оптимизациипроцесса пробоподготовки.
Дорожки: 1 –лизат, рН4,0, 2 – несвязавшаяся фракция, 3 – элюат,рН 5,5, 4 – элюат, рН 7,0, 5 – элюат, рН 7,0, хвостовая часть пика, 6 – регенерация 0,2 М NaOH.Таким образом, разработана методика хроматографической очистки ИЛ-36РА избиомассыштамма-продуцентасиспользованиемкатионообменнойхроматографии,позволяющей получать апирогенный ИЛ-36РА.4.2.3.3.МетодочисткиИЛ-36РАсприменениемкатионообменнойхроматографии: материальный балансВыход биомассы после одного культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА вреакторе с рабочим объёмом 160 л составлял в среднем 3 400 г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
