Диссертация (1145685), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Это потребоваломасштабирования процесса очистки ИЛ-36РА.Очистку на SP Sepharose Fast Flow (GE, США) проводили по разработанной методике,увеличив объём сорбента до 500 мл. Очистка дала такие же результаты, как и в меньшемобъёме, однако, в элюате с рН 7,0 выпадал осадок, содержащий ИЛ-36РА.
Эту фракциюотбрасывали.Объём сорбента Butyl-650 S (Tosoh, Япония) также был увеличен до 300 мл. 50 мМнатрий-фосфатный буфер рН 6,0 с 300 мМ сульфата аммония заменили на натрий-цитратный120буфер рН 6,0 со 150 мМ сульфата аммония. Отмывку примесей проводили 50 мМ натрийцитратным буферным раствором рН 6,0 с 50 мМ сульфата аммония. Элюцию ИЛ-36РАпроводили 50 мМ натрий-цитратным буферным раствором, рН 6,0 без сульфата аммония.Регенерацию сорбента проводили водой. Эти изменения позволили обойтись без диализаполучаемого после концентрирования ИЛ-36РА против цитратного буфера, в котором далеехранится ФС ИЛ-36РА.
Заключительными этапами получения ФС ИЛ-36РА после описанныхшагов были добавление Tween-80 до конечной концентрации 0,01% и стерилизующаяфильтрация с использованием шприцевых фильтров с пористостью 0,22 мкм Millex (MerckMillipore, США). Выход ФС ИЛ-36РА при получении в пилотном масштабе составил в среднем36,8% (в расчете на содержание ИЛ-36РА в биомассе штамма-продуцента) (Таблица 5).Физико-химические характеристики и биологическая активность получаемого сиспользованиемэтогометодаИЛ-36РАсоответствовалитребованиямпроектафармацевтической статьи препарата (ФСП) и были аналогичны характеристикам ИЛ-36РА,полученного нами ранее (Таблица 4).Таблица 5.
Выход и потери ИЛ-36РА в процессе хроматографической очистки сприменением катионообменной хроматографии в пилотном масштабе. Приведены усреднённыезначения измерений от трёх последовательных экспериментов. Концентрации ИЛ-36РА вобразцах на всех стадиях до ультрафильтрации определены методом ИФА, на стадияхультрафильтрации и стерилизации – с помощью набора BCA Protein Assay kit (Thermo FisherScientific, США). В случае измерений методом ИФА значения потерь округлены до целыхчисел. Чистота ИЛ-36РА определена с помощью ОФ-ВЭЖХ. Концентрация ЛПС определена спомощью набора ChromoLAL (CapeCod, США).ОбразецКоличествоПотери ИЛ-КоличествоЧистотаЛПС, EU/мгИЛ-36РА, г36РА наИЛ-36РА, %ИЛ-36РА,ИЛ-36РАстадии, %Биомасса штаммапродуцентаОсветлённый лизатбиомассы рН 7,0Осветлённый лизатбиомассы рН 4,04,154%100%3,65612%88,0%2,81523%67,8%121ОбразецКоличествоПотери ИЛ-КоличествоЧистотаЛПС, EU/мгИЛ-36РА, г36РА наИЛ-36РА, %ИЛ-36РА,ИЛ-36РАстадии, %%Элюат с SP FF - рН 5,52,28019%54,9%Элюат с Butyl-6501,73324%41,7%1,54211%37,1%1,5271,0%36,8%Образец послеультрафильтрацииОбразец послестерилизации81,2%296,1%4Таким образом, была разработана технология хроматографической очистки ИЛ-36РА,пригодная для использования в пилотном промышленном производстве.
С её применениемполучен и очищен биологически активный ИЛ-36РА в количестве 50 г с чистотой более 95% поОФ-ВЭЖХ, с примесью менее 5% метиониновой и дезамидированной форм и содержаниемЛПС менее 10 EU на мг белка. Полученный ИЛ-36РА был использован для проведениядоклинических исследований эффективности и токсичности разрабатываемого лекарственногопрепарата для лечения псориаза.1225.
ЗАКЛЮЧЕНИЕПоскольку для полной биологической активности ИЛ-36РА необходимо отщеплениеинициаторного остатка метионина, нами разработан способ получения безметионинового ИЛ36РА в Escherichia coli. Создана серия плазмид, несущих ген метионинаминопептидазы (МАП)E. coli под контролем различных промоторов, для коэкспресии ИЛ-36РА и МАП ипротестировано их влияние на продукцию ИЛ-36РА.
Наибольшая продукция ИЛ-36РА ссодержанием менее 5% непроцессированной формы с неотщеплённым инициаторным остаткомметионина показана нами для штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), в которомген МАП контролировался индуцируемым арабинозой промотором. Полученный ИЛ-36РАобладал биологической активностью, соответствующей активности ИЛ-36РА, выпускаемогофирмой R&D Systems (США).
Разработанный нами способ получения ИЛ-36РА, включающаякультивирование штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) в биореакторах объёмомдо 250 л, позволяет получить значительно большие количества целевого белка, чем методики,предложенные ранее другими авторами [53, 134].Установлено, что в процессе выделения и хранения при рН > 7.0 ИЛ-36РА подвергаетсядезамидированию.
Для оценки содержания дезамидированной формы ИЛ-36РА в получаемомпрепарате разработан метод анализа на основе кИЭФ. Технология получения и хранения белкаоптимизирована для минимизации этих модификаций.Разработаны три методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, пригодные дляочистки ИЛ-36РА из биомассы культур различных объёмов. Наиболее прогрессивная из нихпозволяетвтечениетрехнедельногопроизводственногоциклаполучать8-10гвысокоочищенного ИЛ-36РА.Наработанный белок использован для проведения доклинических исследованийэффективности и безопасности разрабатываемого во ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» лекарственногосредства на основе ИЛ-36РА для лечения тяжёлых форм псориаза. Было показано отсутствиеострой токсичности в дозах до 200 мг/кг (в 2000 раз превосходит расчётную терапевтическуюдозу для человека), хронической токсичности (20 мг/кг 90 дней), репродуктивной токсичности,пирогенности, мутагенности и аллергенности.1236.
ВЫВОДЫ1.Создана и охарактеризована серия штаммов-продуцентов безметиониновогорекомбинантного ИЛ-36РА человека на основе E. coli BL21 DE3, трансформированных однойих плазмид, несущих ген метионинаминопептидазы E. coli (map) под контролем различныхпромоторов, и плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА человека (IL36RN). Штамм E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A)являетсянаиболеепродуктивнымиобеспечиваетполучение ИЛ-36РА с содержанием непроцессированной формы менее 5%.2.Оптимизирована методика культивирования штамма E.
coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) для применения в биореакторах объёмом до 250 л, что позволяет получитьдо 24 г неочищенного ИЛ-36РА от одного запуска биореактора.3.Разработаны три способа хроматографической очистки ИЛ-36РА из биомассыкультур различных объёмов, которые позволяют получать препарат ИЛ-36РА с чистотой более95% по ОФ-ВЭЖХ, содержащий менее 5% дезамидированной формы и менее 10 EU ЛПС на мгбелка. Наиболее прогрессивная методика позволяет получить 8-10 г очищенного ИЛ-36РА заодин производственный цикл.4.Установлено, что ИЛ-36РА в процессе выделения и хранения при рН > 7,0подвергается дезамидированию.
Для оценки содержания дезамидированой формы ИЛ-36РАразработан метод анализа на основе кИЭФ.5.Подобраны условия хранения ИЛ-36РА, минимизирующие дезамидирование ИЛ-36РА. Разработан состав фармацевтической субстанции ИЛ-36РА. Образцы ФС ИЛ-36РАхранятся в растворе этого состава не менее года без изменений своих свойств.6.Биологическая активность получаемого по разработанной методике в масштабепилотного промышленного производства ИЛ-36РА в модельной системе in vitro на основеклеток линии А549, трансфицированных плазмидой, несущей ген рецептора ИЛ-36,соответствует биологической активности коммерческого стандартного препарата. ПолучаемыйИЛ-36РА способен купировать развитие воспаления in vivo в модели псориазоподобногодерматита на мышах.1247.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙIgG1 – иммуноглобулин G1IL36RN – ген рецепторного антагониста интерлейкина-36LB – Lysogeny broth, «литическая среда», питательная среда для роста культур бактерийpI:C – полиинозин-полицитидиловая кислотаTh1 – Т-клетка хелпер 1 типаTh17 – Т-клетка хелпер 17 типаTLR – Toll-like рецепторВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматографияГЛФ – готовая лекарственная формаГП-ВЭЖХ – гель-проникающая ВЭЖХГПП – генерализованный пустулёзный псориазДСР – динамическое светорассеяниеИЛ – интерлейкинИЛ-1РА – рецепторный антагонист ИЛ-1ИЛ-36РА – рецепторный антагонист ИЛ-36ИПТГ – Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидИФА – иммуноферментный анализИФНγ – интерферон γкИЭФ – капиллярное изоэлектрофокусированиеЛПС – бактериальный липополисахаридМАП – метионинаминопептидазаОЕ – оптическая единицаОФ-ВЭЖХ – обращенно-фазовая ВЭЖХПААГ – полиакриламидный гельТ.п.н.
– Тысячи пар нуклеотидовТФУ – трифторуксусная кислота125ФНОα – фактор некроза опухоли αФС – фармацевтическая субстанцияФСП – фармакопейная статья предприятия1268. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1. Знаменская Л.Ф. Заболеваемость и распространенность псориаза в Российской Федерации /Л. Ф. Знаменская, Л. Е. Мелехина, Е. В. Богданова, А.
А. Минеева // Вестник Дерматологии ИВенерологии – 2012. – № 5 – 20–29 c.2. Мишина О.С. Заболеваемость псориазом и псориатическим артритом среди городского исельского населения Российской федерации / О. С. Мишина, А. С. Дворников, Е. С. Донцова, Л.Н. Борзунова, А. П. Обухов // Вестник Новых Медицинских Технологий Электронное Издание– 2012. – № 1.3. Abbas O. Acrodermatitis continua of Hallopeau is a clinical phenotype of DITRA: evidence that it isa variant of pustular psoriasis / O.
Abbas, S. Itani, S. Ghosn, A. G. Kibbi, G. Fidawi, M. Farooq, Y.Shimomura, M. Kurban // Dermatol. Basel Switz. – 2013. – Т. 226 – № 1 – 28–31 p.4. Afonina I.S. Proteolytic Processing of Interleukin-1 Family Cytokines: Variations on a CommonTheme / I. S. Afonina, C. Müller, S. J.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
