Диссертация (1145685), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Кроме того, часть ИЛ-36РА выпала в осадок, который удалили из растворапри центрифугировании.Обработку Triton X-114 в концентрации 0,125% при +30 °С повторили дважды. Послепервой обработки удалось снизить концентрацию ЛПС в растворе менее чем до 30 EU/мл послепервой обработки и менее чем 5 EU/мл после второй (Таблица 1). Потери объёма образца ИЛ36РА на каждом этапе обработки 0,125% Triton X-114 при +30 °С составили 4-5% (Таблица2).Концентрация ИЛ-36РА в растворе оставалась неизменной и составляла 2 мг/мл. Такимобразом, с точки зрения выхода конечного продукта предпочтительным подходом оказываетсядвукратная обработка 0,125% Triton X-114 при +30 °С.Эти данные вполне согласуются в описанными в литературе [83, 177]. При этомконцентрация 0,125% Triton X-114, видимо, оказывается на грани минимальной достаточнойдля эффективной работы системы, т.к. было показано, что при концентрации 0,1% Triton X-114эффективностьочисткиснижается[177].Приэтомкритическаяконцентрациямицеллообразования (далее СМС) для Triton X-114 составляет 0,0113% по даннымпроизводителя (Thermo Scientific, США), в концентрации ниже СМС детергент неизбежноостанется растворённым в водной фазе.Таким образом, оптимальными условиями удаления ЛПС из препаратов ИЛ-36РАявляются: концентрация Triton X-114 0,125%, время инкубации при +4 °C – 30 минут,нагревание проб до температуры от +23 °С до +30 °С - до полного помутнения образца,центрифугирование 1 минута при 5000 g или 5 минут при 1000 g в нагретом до +25 °C роторе.Этот метод может быть применим для большинства полипептидов в типичных биологическихбуферных растворах без примесей.
Однако такую очистку необходимо проводить до106добавления к образцу других детергентов, используемых при хранении, т.к. это делаетневозможным разделение фаз в данных условиях [161, 170].Таблица 2. Концентрация белка, ЛПС и Triton X-114 в пробах ИЛ-36РА после обработкиTriton X-114 в различных условиях. Указан разброс значений в трёх исследованных образцах.Концентрация белка измерялась после диализа, содержание ЛПС определялась до диализа.Концентрации Triton X-114 сравнивались между группой после диализа и соответствующейгруппой до диализа.
n = 3, тест Манна-Уитни, *,† p < 0,05.Исходный образец1х обработка 0,125% TritonX-114 при +30°С2х обработка 0,125% TritonX-114 при +30°С2х обработка 0,125% TritonX-114 при +30°С и диализ1х обработка 0,125% TritonX-114 при +37°С1х обработка 0,125% TritonX-114 при +37°С и диализ1х обработка 0,25% TritonX-114 при +37 °С1х обработка 0,25% TritonX-114 при +37 °С и диализОбъём(ИЛ-36РА)(ЛПС)пробы (мкл)(мг/мл)(EU/мл) (мкг/мл)100068000940-95022-29152-163900-9100-4161-167*890-9102000(Triton X-114)1985-2046940-950940-9500-41811-1857910-920900-9100,3-0,6*144-171†0,3-0,7†2-41819-1878Однако, как было отмечено выше, после протокола очистки в водной фазе остаётсяпримесь Triton X-114 в концентрации ниже СМС.
Поэтому следующими задачами сталиопределение остаточного Triton X-114 в растворе и очистка от него.107Существуют методы колориметрического определения неионных детергентов, подобныхTriton X-114 [176]. Они требуют применения зачастую весьма токсичных реагентов и поэтомуне очень удобны в использовании. Благодаря наличию в молекуле Triton X-114 фенольногокольца (Рисунок 51), он может быть детектирован УФ-детектором при длине волны 280 нм.Однако при этой длине волны поглощают свет и белки, содержащие остатки триптофана итирозина.Рисунок51.Общаяхимическаяформула(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликолей или детергентов серии Triton. Каждый из них представляет из себя смесьполимеров с различной длиной цепи.
Для Triton X=114 n=7-8, для Triton X-100 n=9-10.Удобным и быстрым методом количественного определения примеси Triton X-114 вобразце явился ОФ-ВЭЖХ с детекцией пиков по поглощению света при 280 нм. Triton X-114легко дифференцируется от пика ИЛ-36РА (Рисунок 52). Количество Triton X-114 определяетсяотносительно площади пика Triton X-114 в стандартном образце. Метод обладаетчувствительностью до 0,005%.Примесь Triton X-114 после очистки от ЛПС составила в среднем 160±15 мкг/мл поданным ОФ-ВЭЖХ (Таблица 2).
Это примерно соответствует критической концентрациимицеллообразования Triton X-114, которая составляет около 113 мкг/мл (0,21 мМ или 0,0113%).Отличие может объясняться различиями в солевом составе раствора, а также случайнымотбором малого количества гидрофобной фазы после разделения.Методы очистки растворов от примеси детергентов, в том числе Triton X-114, основанына тех же принципах, что и методы очистки растворов от ЛПС. Происходит разделение молекулдетергентов и молекул белка по размеру, заряду или гидрофобности. По описанным вышепричинам опробованные хроматографические методы очистки, основанные на разделениимолекул по заряду и гидрофобности, не были эффективны для ИЛ-36РА.108Рисунок 52. Типичная ОФ-ВЭЖХ хроматограмма обработанных Triton X-114 образцовИЛ-36РА до и после диализа. Пик 1’15’’ соответствует ИЛ-36РА, пик 3’10’’ соответствуетTriton X-114.Методы, основанные на отделении молекул детергентов по размеру, включают в себягель-фильтрацию [5], диафильтрацию и диализ [171].
Гель-фильтрация удобна только дляочистки образцов в аналитических количествах. Для очистки проб большого объёма намногоудобнее методы диафильтрации и диализа. Однако, оба метода могут эффективно работатьтолько в случае, когда концентрация Triton X-114 ниже СМС. Молекулярный вес мицеллыTriton X-114 в зависимости от условий может достигать около 100 кДа [151], в то время как весодиночной молекулы Triton X-114 составляет 537 Да.
Это позволяет удалять его с помощьюмембран с соответствующим порогом отсечения [177].Диализ образца ИЛ-36РА с примесью 160±15 мкг/мл Triton X-114 (по данным ОФВЭЖХ) после очистки от ЛПС проводился против 50 мМ натрий-цитратного буфера, рН 6,06,2, в котором предполагалось дальнейшее хранение и использование ФС ИЛ-36РА.Концентрация Triton X-114 в растворе ИЛ-36РА после диализа составила 0,04% (Таблица 2).При большем разбавлении представляется возможным достичь большей эффективностидиализа.1094.2.2.4.МетодочисткиИЛ-36РАсприменениеманионообменнойхроматографии: материальный балансТехнология получения ФС ИЛ-36РА в масштабе лабораторного производства состоит изследующих стадий: культивирование штамма-продуцента, лизис биомассы, осветление еёметодом флоккуляции, негативная анионообменная хроматография на сорбенте Q SepharoseFast Flow (GE, США), гидрофобная хроматография на сорбенте Butyl-650 S (Tosoh, Япония),ультрафильтрационное концентрирование на мембране Ultracel PL-10 (Merck-Millipore, США),очистка от ЛПС с помощью двухфазной системы с детергентом Triton X-114 и диализ.Заключительными этапами получения ФС ИЛ-36РА стали добавление Tween-80 до конечнойконцентрации 0,01% и стерилизующая фильтрация с использованием шприцевых фильтров спористостью 0,22 мкм Millex (Merck-Millipore, США).
Выход ИЛ-36РА после всех этаповочистки составил в среднем 51,4% (в расчете на содержание ИЛ-36РА в биомассе штаммапродуцента) (Таблица 3).Таблица 3. Выход и потери ИЛ-36РА в процессе получения ФС в масштабелабораторногопроизводства.Приведеныусреднённыезначенияизмеренийоттрёхпоследовательных экспериментов.
Концентрации ИЛ-36РА на всех стадиях до диализаопределены методом ИФА, на стадиях диализа и стерилизации – с помощью набора BCAProtein Assay kit (Thermo Fisher Scientific, США). В случае измерений методом ИФА значенияпотерь округлены до целых чисел. Чистота ИЛ-36РА определена с помощью ОФ-ВЭЖХ.Концентрация ЛПС определена с помощью набора ChromoLAL (CapeCod, США).ОбразецИЛ-Потери36РА, г ИЛ-36РАКоличествоЧистотаЛПС,ИЛ-36РА, %ИЛ-EU/мг36РА, %ИЛ-на стадии,36РА%Биомасса штамма-1,216100,0%продуцентаОсветлённый лизат1,07012%88,0%0,91015%74,8%биомассыЛизат биомассы послефлоккуляции110ОбразецИЛ-Потери36РА, г ИЛ-36РАКоличествоЧистотаЛПС,ИЛ-36РА, %ИЛ-EU/мг36РА, %ИЛ-на стадии,36РА%Фракция, не связавшаяся0,8823%72,6%31,3%0,69721%57,3%96,2%98140,6901%56,7%0,6289%51,6%Образец после диализа0,6280,0%51,6%Образец после0,6250,5%51,4%95,8%2сQФракция,элюировавшаяся с Butyl650Образец послеультрафильтрацииОбразец после Triton X114стерилизацииПосле завершения процедуры очистки перед дальнейшим использованием проводиливыходной контроль полученной ФС ИЛ-36РА на соответствие требованиям разработанногопроекта фармацевтической статьи предприятия (ФСП) (Приложение 1).
Результатов контроляФС ИЛ-36РА приведены в Таблице 4.Таблица 4. Результаты тестирования типичного образца ФС ИЛ-36РА на соответствиетребованиям проекта ФСП.НаименованиеТребования проекта ФСПРезультаты анализаПрозрачная или слегкаПрозрачная бесцветнаяопалесцирующая бесцветнаяжидкостьпоказателейОписаниежидкость111НаименованиеТребования проекта ФСПРезультаты анализа1. БиологическийДолжен достоверно подавлятьДостоверно подавляетметодпродукцию интерлейкина-8продукциюклетками линии А-549/IL36R+,интерлейкина-8 клеткамивызванную 10 нг/мл интерлейкина-линии36 гамма, в концентрации не болееА-549/IL36R+, вызванную12 нг/мл (биологический метод)10 нг/мл интерлейкина-36показателейПодлинность:- рецепторныйантагонистинтерлейкина-36гамма, в концентрации 12нг/мл2. Обращенно-Время удерживания основногоСоответствуетфазоваяпика на хроматограмме растворавысокоэффективнаяпрепарата должно соответствоватьжидкостнаявремени удерживания основногохроматографияпика рабочего стандартного(ОФ-ВЭЖХ)образца3.
КапиллярноеИзоэлектрическая точка основнойИзоэлектрическая точкаизоэлектрическоеформы белка должна бытьосновной формы белкафокусирование(5,230,05)5,20Должен быть прозрачным поПрозрачный(кИЭФ)Прозрачностьсравнению с водой иливыдерживать сравнение с эталономI112НаименованиеТребования проекта ФСПРезультаты анализаЦветностьДолжен быть бесцветныйБесцветныйрНОт 6,0 до 6,56,1ПосторонниеСуммарное содержаниеСуммарное содержаниепримесипостороннихпосторонних1.ВЭЖХнеидентифицированных примесейнеидентифицированныхне должно превышать 5%,примесей – 2,64%,содержание единичнойсодержание единичнойнеидентифицированной примеси –неидентифицированнойне более 2,5% от площадипримеси – 1,05%показателейосновного пика2. ОФ-ВЭЖХСуммарное содержаниеСуммарное содержаниепосторонних примесей не должнопосторонних примесей –превышать 5%1,99%Родственные примеси Содержание дезамидированнойБактериальныеСодержаниеформы с pI (5,060,05) не должнодезамидированной формыпревышать 5 %– 3,12%Не более 10 ЕЭ на 1 мг белка4 ЕЭ на 1 мг белкаНе менее 5,0 мг/мл5,0 мг/млэндотоксиныКоличественноеопределение:- рецепторныйантагонистинтерлейкина-36113Таким образом, разработанная технология позволила получать высокоочищенный ИЛ36РА, соответствующий требованиям разработанного проекта ФСП, при единовременнойобработке биомассы массой 240-300 г от одного культивирования штамма-продуцента ИЛ-36Рав биореакторе объёмом 10 литров.4.2.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
