Диссертация (1145685), страница 2
Текст из файла (страница 2)
1134.2.3.1. Оптимизация метода кислотного фракционирования лизата биомассыштамма-продуцента ИЛ-36РА ................................................................................................... 1134.2.3.2. Оптимизация метода очистки ИЛ-36РА с применением катионообменнойхроматографии 1154.2.3.3.
Метод очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной хроматографии:материальный баланс.................................................................................................................. 1195.Заключение ................................................................................................................... 1226.Выводы .......................................................................................................................... 1237.Список сокращений ..................................................................................................... 1248.Список литературы ...................................................................................................... 1269.Приложение ..................................................................................................................
14671. ВВЕДЕНИЕ1.1. Актуальность темы исследованияРабота проводилась в рамках проекта по разработке перспективных подходов к терапиипсориаза.Псориаз является многофакторным заболеванием, поражающим до 5% населения вэкономически развитых странах. Псориатический артрит развивается у 5-25% больныхпсориазом, проявляется симметричными деструктивными изменениями суставов [17]. В Россиипроживает более 300 тысяч больных псориазом [2].
Помимо вульгарного псориаза выделяютболеетяжёлыеформызаболевания,характеризующиесяобширнымиболезненнымивысыпаниями, их особенной локализацией, образованием пустул, поражением суставов исистемными расстройствами. Наиболее тяжёлой формой псориаза является генерализованныйпустулёзный псориаз (ГПП).Для лечения среднетяжелых и тяжелых форм псориаза, наряду со средствами местноголечения и системными иммунодепрессантами [64] в последние год широкое применениеполучилифармацевтическиепрепаратысантицитокиновойактивностью.Высокуюклиническую эффективность демонстрируют препараты, нейтрализующие биологическуюактивность фактора некроза опухолей-альфа [113], блокаторы рецептора интерлейкина (ИЛ)-12и ИЛ-23 [101], терапевтические антитела против ИЛ-17А [112].Важную роль в активации и поддержании воспаления в коже, пораженной псориазом,играют цитокины семейства ИЛ-36.
Это семейство включает три провоспалительных цитокина- ИЛ-36α, ИЛ-36β и ИЛ-36γ - и специфический антагонист рецептора ИЛ-36 (ИЛ-36РА). Рядмутаций в гене IL36RN, кодирующем ИЛ-36РА, способен вызывать развитие генерализованногопустулёзного псориаза.Предполагается, что блокада активации рецептора ИЛ-36 с помощью введениярекомбинантного ИЛ-36РА человека может быть высокоэффективным подходом к терапииданного дерматоза. В связи с этим разработка новых лекарственных средств на основе ИЛ-36РАдля лечения псориаза является актуальной задачей.Настоящее исследование посвящено разработке методик получения рекомбинантногоИЛ-36РА человека в бактериальном продуценте и его очистки, а также изучению физикохимических свойств и биологической активности полученного цитокина. Результаты8проведенных исследований легли в основу лабораторного и опытно-промышленногорегламентов получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА.1.2.
Степень разработанности темыНаиболее тяжёлые формы псориаза, такие как генерализованный пустулёзный псориаз,не отвечают на обычную терапию. Для их лечения активно применяют различныеантицитокиновые иммуносупрессивные препараты. Это этанерцепт (внеклеточный доменрецептора ФНОα, сшитый с Fc-фрагментом IgG1 человека), инфликсимаб и адалимумаб(моноклональные антитела к ФНОα) [113], секукинумаб (моноклональные антитела к ИЛ-17А)[112], устекинумаб (моноклональные антитела к общей для ИЛ-12 и ИЛ-23 субъединице p40)[101] и др. Однако, эти препараты обладают системными побочными эффектами [45, 84, 112].
Всвязи с этим разработка препаратов, селективно действующих на уровне наружных кожныхпокровов, например, ингибирующих активность ИЛ-36, является актуальной практическойзадачей [32].В настоящее время разрабатывается несколько таких препаратов. Моноклональныеантитела к рецептору ИЛ-36 независимо получены компаниями Boehringer Ingelheim(Германия) [44] и Anaptys Bio (США) [156]. Оба препарата находятся на первой стадииклиническихиспытаний.Преимуществоразрабатываемогопрепаратанаосноверекомбинантного ИЛ-36РА человека в использовании при его производстве прокариотическогопродуцента и неаффинных методов очистки, что обуславливает меньшую стоимость егопроизводства. Получение ИЛ-36РА с отщеплённым N-концевым остатком метионина(безметионинового) позволяет добиться максимальной биологической активности препарата.1.3. ЦельЦель данной работы - получение рекомбинантного безметионинового антагонистарецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологическихсвойствЗадачи:1.
Создать бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного безметиониновогоИЛ-36РА человека2. Разработать технологию получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА3. Изучить физико-химические свойства полученного ИЛ-36РА4. Изучить биологические свойства полученного ИЛ-36РА91.4. Методология и методы исследованияВ ходе работы создан штамм-продуцент на основе E. coli BL21[DE3], синтезирующийрастворимый биологически активный рекомбинантный ИЛ-36РА человека с отщепленным Nконцевым остатком метионина. Для этого штамм трансформирован плазмидой, несущей ген,кодирующий ИЛ-36РА человека, и плазмидой, несущей ген метионинаминопептидазы E. coli.Разработана схема двухстадийной хроматографической очистки ИЛ-36РА, включающейкатионообменнуюигидрофобнуюхроматографию.Изученыпост-трансляционныемодификации полученного препарата ИЛ-36РА, показана способность ИЛ-36РА к спонтанномудезамидированию при значениях рН среды выше 7, показана зависимость биологическойактивности ИЛ-36РА от отщепления N-концевого инициаторного остатка метионина.Биологическая активность полученного препарата ИЛ-36РА подтверждена in vitro в модельнойсистеме на основе клеточной линии А549.
Также показана способность полученного препаратаИЛ-36РА купировать индуцированный псориазоподобный фенотип у мышей при подкожномвведении.1.5. Научная новизнаТехнология получения безметиониновых белков, состоящая в создании штамма,несущего плазмиду с геном интереса и плазмиду с геном метионинаминопептидазы, примененапо отношению к ИЛ-36РА впервые. Кроме того, впервые исследованы пост-трансляционныемодификации ИЛ-36РА, изучено их влияние на его биологическую активность, подобраныусловия выделения и очистки ИЛ-36РА, минимизирующие эти изменения.Впервые разработана технология получения биологически активного ИЛ-36РА,позволяющая получать до 10 г высокоочищенного ИЛ-36РА из 160 л культуры в течениетрехнедельного производственного цикла.1.6.
Теоретическая и практическая значимость работыПроведенное исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА, позволяющее болееполно понимать механизм действия этого цитокина в организме млекопитающих, определяеттеоретическую значимость работы. Тот факт, что ИЛ-36РА человека способен купироватьпсориазоподобный фенотип у мышей, является прямым доказательством структурной схожестиИЛ-36РА человека и мыши, и косвенным доказательством относительно недавнеговозникновения семейства ИЛ-36 в эволюции.10Практическая ценность работы состоит в разработке промышленной технологииполучения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА человека с доказанной биологическойактивностью, на основе которой изготавливается готовая лекарственная форма ИЛ-36РА в видераствора для подкожного введения, 5 мг/мл.
Успешно завершены доклинические испытанияэффективности и безопасности препарата в качестве кандидатного лекарственного средства длятерапии тяжёлых форм псориаза.1.7. Положения, выносимые на защиту1. Создана серия штаммов-продуцентов безметионинового рекомбинантного ИЛ36РА человека на основе E. coli BL21[DE3]. Установлено, что штамм E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) наиболее продуктивен и обеспечиваетполучение ИЛ-36РА с содержанием непроцессированной формы менее 5%.2.
Биологическая активность получаемого ИЛ-36РА соответствует биологическойактивности коммерческого стандартного препарата.3. Установлено, что в процессе выделения и хранения при рН > 7,0 препарат ИЛ36РА подвергается дезамидированию.4. Подобраны условия выделения и хранения ИЛ-36РА, минимизирующие егодезамидирование.5. Впервые разработан метод получения ИЛ-36РА, позволяющий получать 8-10 гвысокоочищенного ИЛ-36РА за один производственный цикл (заявка на патентРФ № 2017103888 от 06.02.2017).1.8. Апробация результатовОсновные результаты работы изложены в статьях:Колобов А.А., Кондратьева Е.В., Кудлинг Т.В., Карасев М.
М., Калинин Р.С., ХижинаА.А., Нимирицкий П.П., Стефанов В.Е., Петров А.В. 2017. Получение ИЛ-36РА человека вEscherichia coli при коэкспресии с метионинаминопептидазой E. coli. I. Сравнение продукцииИЛ-36РА различными штаммами. Цитология. 59 (7): 482-488Колобов А.А., Кондратьева Е.В., Шарафутдинова Т.А., Калинин Р.С., Нимирицкий П.П.,Стефанов В.Е., Петров А.В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
