Диссертация (1145638), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Только усамцов sbr12/Dp(1;Y) фасцикуляция (объединение в пучок) аксонов фоторецепторных нейроновв ГАИД выглядит нарушенной (Рис. 47). Аксоны ФрН у самцов sbr12/Dp(1;Y) располагаютсяхаотично (Рис. 47Д), а не параллельными пучками, как у самцов других генотипов (Рис. 47Е). Усамок всех тестированных генотипов нарушения фасцикуляции аксонов ФрН не выявлены (Рис.48), а характер расположения аксонов ФрН соответствует таковому у самцов Oregon-R,sbr+/Dp(1;Y и L4/Dp(1;Y). Таким образом, только у самцов присутствие аллеля sbr12 нарушаетхарактер расположения аксонов фоторецепторных нейронов в ГАИД, в то время какприсутствие аллеля sbr12 у гетерозиготных самок sbr12/ sbr+ не оказывает влияния на этотпризнак.За пределами ГАИД аксоны фоторецепторов у самцов sbr12/Dp(1;Y), как и у личинокдругих генотипов, формируют оптический нерв, идущий в мозг.
Тем не менее, признакинарушения упорядоченности аксонов фоторецепторов, наблюдаемые у самцов sbr12/Dp(1;Y),указывают на влияние аллеля sbr12 на процесс формирования отростков, заключающийся в ихросте, ветвлении, установлении межклеточных взаимодействий как между отростками, так ипри формировании зоны их терминации. Известна важная роль молекул клеточной адгезии(МКА) не только в фасцикуляции, но в нацеливании аксонов, а нарушение функции многихМКА приводит к дефектам морфогенеза (Kurusu et al., 2012; Missaire and Hindges, 2015). Приэтом, нейроны и их отростки, образовавшие неправильные связи, как правило, уничтожаются(Buss et al., 2006; Rogulja-Ortmann et al., 2007; Jiang and Reichert, 2012; Baek et al., 2013). Такимобразом, наблюдаемые у самцов sbr12/Dp(1;Y) на стадии имаго дефекты структуры и очагинейродегенерации в медулле могут быть следствием элиминации нейронов, сформировавшихаберрантные синаптические связи.102Рисунок 47.
Характер расположения аксонов фоторецепторных нейронов в ГАИД личинок самцов3-го возраста. Фоторецепторные нейроны (ФрН, на панелях Д и Е - ФР) и их аксоны маркированыантителами к белку HRP. А-Г - максимальные проекции серий оптических срезов, проходящих череззону ГАИД, в которой находятся ФрН и их аксоны, в ГАИД личинок самцов следующих генотипов: А sbr12/Dp(1;Y); Б – Oregon-R; В – sbr+/Dp(1;Y); Г – L4/Dp(1;Y). Схемы расположения аксонов ФрН: Д - усамцов sbr12/Dp(1;Y) аксоны не упорядочены, Е – у самцов остальных генотипов аксоны ФрН идутпараллельно друг другу. Масштабная линейка: 20 мкм.103Рисунок 48. Характер расположения аксонов фоторецепторных нейронов в ГАИД личинок самок3-го возраста. ФрН и их аксоны маркированы антителами к белку HRP.
Максимальные проекции серийоптических срезов, проходящих через зону, в которой находятся ФрН и их аксоны, в ГАИД личиноксамок следующих генотипов: А - sbr12/ sbr+; Б – Oregon-R; В – L4/sbr+. Характер расположения аксоновФрН соответствует норме. Масштабная линейка: 20 мкм.1043.3.2 Признаки нейродегенерации в медулле самцов sbr12/Dp(1;Y) на стадии личинки3-го возрастаОкраска антителами к белку HRP позволяет визуализировать нейропили в мозгеD. melanogaster. В норме нейропиль медуллы на стадии личинки 3-го возраста выявляется вполушарии мозга в виде безъядерной серповидной зоны, маркированной антителами к белкуHRP (Рис.49).
Ядра клеток располагаются на периферии этого нейропиля. Анализ структурымедуллы развивающихся зрительных долей мозга показал, что только у самцов sbr12/Dp(1;Y) вмедулле выявляются признаки нейродегенерации: округлые области, не маркированныеантителами к белку HRP и не содержащие ядер клеток (Рис. 49). Кроме того, у самцовsbr12/Dp(1;Y) нарушены форма медуллы и характер расположения клеток в этой области мозга:медулла имеет неровные края и неупорядоченную структуру, а также содержит участки,содержащие тела нервных клеток, которые внедряются в районы, в норме формируемыеотростками нервных клеток.Такая структура медуллы указывает на нарушение процессаморфогенеза этого нейропиля у самцов sbr12/Dp(1;Y). У самцов других генотипов (Рис. 49) исамок всех тестированных генотипов (Рис.
50) признаки нейродегенерации в медулле иизменение структуры этого нейропиля не выявлены.Нейропильмедуллыявляетсявысокоупорядоченнойструктурой:отросткифоторецепторов R7-R8, образуют синаптические связи с отростками нейронов ламины иотростками других нейронов медуллы в строго определенном порядке. В результате, в медуллеформируется ячеистая структура, образованная функциональными единицами – картриджамиотростков (Apitz and Salecker, 2014).
Аномалии структуры медуллы, выявленные у самцовsbr12/Dp(1;Y) на стадии имаго (Рис. 37, 39, 44), позволяют предположить, что причинойвозникновения этих нарушений могут быть дефекты формирования аксонов нейронов,образующих синаптические связи в этом нейропиле. В результате, у имаго будет нарушена нетолько форма медуллы, но и её внутренняя структура, образованная картриджами отростков.Для проверки данного предположения мы проанализировали внутреннюю структуру медуллына парафиновых срезах мозга, а также характер расположения аксонов нейронов R7-R8,оканчивающихся в медулле, на целом мозге имаго.105Рисунок 49.
Структура медуллы в полушарии мозга у самцов различных генотипов на стадииличинок 3-го возраста. Дефекты структуры медуллы и нарушение характера расположения ядерклеток, а также признаки нейродегенеративных процессов (округлые области, лишенные окраски DAPIи HRP), выявляются только у самцов sbr12/Dp(1;Y). Ядра клеток окрашены при помощи DAPI, нейропильвизуализировали при помощи антител к белку HRP.
Желтые стрелки указывают на медуллу, желтымизвездочками отмечены ближайшие к стрелке очаги нейродегенерации. Масштабная линейка: 50 мкм.106Рисунок 50. Структура медуллы в полушарии мозга у самок различных генотипов на стадииличинок 3-го возраста. Дефекты структуры и признаки нейродегенерации в медулле у самок невыявлены.
Ядра клеток окрашены при помощи DAPI, нейропиль визуализировали при помощи антител кбелку HRP. Масштабная линейка: 50 мкм.3.3.3 Дефекты коннектома в медулле самцов-имаго sbr12/Dp(1;Y)В зрелых фоторецепторных нейронах синтезируются белки родопсины (Rhodopsines),обеспечивающие их функциональную активность.
Детекция автофлуоресценции позволяетвыявить расположение фоторецепторов и их отростков в глазу и мозге D. melanogaster, но непозволяет идентифицировать отдельные типы фоторецепторов (R1-R8). Аксоны нейронов R1R6 в норме оканчиваются в ламине, а аксоны нейронов R7 и R8 нейронов – в медулле (Apitz andSalecker, 2014). Отростки нейронов R7 и R8 вместе с отростками других нейронов медуллы и107ламины формируют в медулле строго упорядоченный коннектом, состоящий из отдельныхфункциональных единиц – картриджей (Apitz and Salecker, 2014), поэтому по характерурасположения их аксонов в медулле можно судить о её внутренней архитектуре.Анализ автофлуоресценции в медулле показал, что у самцов дикого типа (линия OregonR) и у самцов sbr+/Dp(1;Y) окончания аксонов фоторецепторных нейронов R7 и R8располагаются упорядоченно, формируя ряды в дистальной части медуллы (Рис.
51 А, Б). Усамцов L4/Dp(1;Y), терминальные части аксонов фоторецепторов R7 и R8 тоже выявляются ввиде непрерывных упорядоченных рядов (Рис. 51 В). Кажущееся уменьшение количествааксонов фоторецепторных нейронов у таких самцов может быть следствием недостатка белкаSBR, если аллель sbr+ в Y-хромосоме функционально не идентичен аллелю sbr+ в X-хромосоме.Рисунок 51. Аксоны фоторецепторных нейронов R7 и R8 в медулле зрительной доли мозга усамцов различных генотипов. Стрелками маркирован ряд, образованный окончаниями аксонов ФрН.Богатая родопсином область у самцов L4/Dp(1:Y) – попавшая на препарат ламина.
Ядра клетококрашены при помощи DAPI, визуализация родопсина осуществлена за счет детекцииавтофлуоресценции родопсина. Масштабная линейка: 50 мкм.108У самцов sbr12/Dp(1;Y) структура медуллы нарушена, а вместе с ней и характеррасположения аксонов фоторецепторных нейронов. Аксоны ФрН R7 и R8 располагаютсяхаотично (Рис. 52) и не формируют упорядоченные ряды, как у самцов других генотипов (Рис.51). Такой характер расположения аксонов фоторецепторных нейронов у самцов sbr12/Dp(1;Y)указывает на нарушение у них процессов, контролирующих рост и нацеливание аксонов.Рисунок 52. Аксоны фоторецепторных нейронов R7 и R8 в медулле зрительной доли мозга усамцов sbr12/Dp(1;Y).
А – общий вид зрительной доли мозга; Б, В – увеличенные фрагменты медуллы,отмеченные соответствующими буквами на общем виде (А). Стрелками указаны некоторыесинаптические окончания аксонов ФрН. Синаптические окончания расположены хаотично, и необразуют характерных параллельных рядов в дистальной части медуллы. Ядра клеток окрашены припомощи DAPI, визуализация аксонов ФрН осуществлена за счет детекции автофлуоресценцииродопсина. Масштабная линейка: А - 50 мкм; Б, В – 25 мкм.109Аномалии расположения аксонов фоторецепторных нейронов в медулле у самцовsbr12/Dp(1;Y) поднимают вопрос о том, сопровождается ли эти дефекты нарушениемвнутренней структуры медуллы и ламины, в которых в норме отростки нейронов формируютконнектом, состоящий из функциональных единиц – картриджей. Чтобы ответить на этотвопрос, мы провели сканирование парафиновых срезов голов самцов, окрашенныхгематоксилином-эозином, при помощи конфокального микроскопа, детектируя флуоресценциюэтого гистологичесого красителя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
