Диссертация (1145638), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Масштабнаялинейка: 50 мкм.Рисунок 41. Структура зрительных долей мозга самок D. melanogaster различных генотипов.Окраска срезов - гематокилин-эозином. Верхний ряд - фрагменты парафиновых срезов зрительныхдолей. Нижний ряд - те же срезы с отмеченным пунктирной линией контуром медуллы. У самок всехтестированных генотипов структурных изменений медуллы не выявлено. Масштабная линейка: 100мкм.94Отсутствие нарушения морфогенеза мозга у самок sbr12/sbr+, с одной стороны,соответствует тому, что такие самки в возрасте 3-5 суток не обнаруживают отклонений вактивности в тесте на ОГТ, но оставляет открытым вопрос о причинах, лежащих в основеснижения активности таких самок по мере их взросления. Прогрессирующее снижениеактивности как среди самок, так и среди самцов, выявляемое в тесте на ОГТ, позволяетпредположить, что в основе нарушения активности особей могут лежать аномалии нервнойсистемы,прогрессирующиепомеревзросленияособей-например,вызванныенейродегенеративными процессами в мозге.3.2.2 Анализ общего уровня нейродегенерации в мозге у самок и самцовD.
melanogaster в зависимости от возрастаДля выяснения, связано ли нарушение поведения с процессами нейродегенерации вмозге, нами был проведен анализ тонких парафиновых срезов мозга у самцов и самокразличных генотипов в разных возрастных группах.3.2.2.1 Присутствие аллеля sbr12 в гетерозиготе приводит к увеличению интенсивностинейродегенерации в мозге у самцов D. melanogaster в молодом возрастеВ работу были взяты самцы 4 генотипов и самки 3 генотипов в возрасте 3-5 суток. Стольранний для проявления нейродегенерации возраст был выбран специально: в этом возрасте усамцов sbr12/Dp(1;Y) активность в тесте на ОГТ уже значительно снижена относительно таковойу самцов других генотипов, активность самцов L4/Dp(1;Y) снижена в меньшей степени, аактивность самок всех тестированных генотипов не нарушена. Такие различия позволяютвыявить вклад различных составляющих генотипа самцов и самок в формированиесоответствующего фенотипа.Результатыстатистическойобработкирезультатов,полученныхприанализепарафиновых срезов голов самцов, представлены на Рис.
42. В качестве показателяинтенсивности нейродегенерации оценивали долю поврежденной ткани в пересчете на объеммозга. Такие возможности предоставляет программа анализа изображений ImageJ.Вэксперимент также были взяты самцы sbr12/Dp(1;Y) в первые сутки после вылупления, чтопозволило выявить возрастную динамику нейродегенерации у таких самцов на самых раннихэтапах.95Рисунок 42. Показатель нейродегенерации в мозге у самцов различных генотипов: доляповрежденной ткани, % от объема мозга.
В возрастной категории 3-5 суток самцы sbr12/Dp(1;Y)статистически значимо отличаются от самцов других генотипов, а также от самцов sbr12/Dp(1;Y) ввозрасте 0-6 часов после вылета (п.в.) согласно U-критерию Манна-Уитни (p<0.05).Согласно результатам эксперимента, в возрасте 3-5 суток у самцов всех тестированныхгенотипов выявляются отверстия на срезах мозге, что свидетельствует о том, что дегенерациянервных клеток происходит и в норме.
При этом, самцы sbr12/Dp(1;Y) характеризуются болеевысокими показателями нейродегенерации по сравнению с самцами других тестированныхгенотипов (Рис. 42).Примечательно, что у самцов sbr12/Dp(1;Y) в возрасте 0-6 часов п.в. доля поврежденнойткани мозга сопоставима с таковой у самцов других генотипов в возрасте 3-5 суток (Рис. 42).Статистически значимых отличий по доле поврежденной ткани между самцами, не несущимиаллель sbr12, не выявлено. Эти данные указывают на то, что у самцов-имаго sbr12/Dp(1;Y)инициация очагов нейродегенерации формируется очень рано и в возрасте 3-5 сутокзатрагивает уже область мозга, большую, чем у самцов других генотипов.Полученные результаты свидетельствуют о том, что только присутствие аллеля sbr12 усамцов приводит к увеличению интенсивности нейродегенерации в мозге. Следует обратитьвнимание на то, что уровень НД у самцов L4/Dp(1;Y), проявляющих сниженную активность втесте на ОГТ, статистически значимо не отличается от такового у самцов дикого типа (OregonR) и самцов sbr+/Dp(1;Y), характеризующихся высокой активностью в этом тесте.
Такимобразом, одним только повышением общего уровня НД нельзя объяснить причину сниженияактивности в тесте на ОГТ у самцов L4/Dp(1;Y).963.2.2.2 Нейродегенерация в мозге у самок D. melanogasterВлияние аллеля sbr12 у самок менее выражено, чем у самцов. Среди самок в возрасте 3-5суток статистически значимые отличия по доле поврежденной ткани в мозге не выявлены(Рис. 43).Рисунок 43. Показатель нейродегенерации в мозге у самок различных генотипов: доляповрежденной ткани, % от объема мозга. В возрастной категории 3-5 суток статистически значимыеотличия среди самок всех тестированных генотипов не выявлены.Примечательно, что в возрастной категории 3-5 суток параметры нейродегенерации усамок (повреждено, в среднем, 0,1% от объёма мозга) схожи с таковыми у самцов: у всехособей, за исключением самцов sbr12/Dp(1;Y), доля поврежденной ткани в среднем составляет0,1% от объема мозга.3.2.3 Наличие аллеля sbr12 у самцов sbr12/Dp(1;Y) приводит к возникновениюнейродегенеративных повреждений преимущественно в сетчатке, медулле зрительныхдолей и антеннальном механосенсорном моторном центреАнализ общих параметров нейродегенерации у самцов и самок не позволил определитьпричину снижения активности в тесте на ОГТ у мух различных генотипов.
В частности, мы необнаружили статистически значимого повышения общего уровня нейродегенерации у самцовL4/Dp(1;Y), для которых характерно статистически значимое снижение активности в тесте наОГТ уже в возрасте 3-5 суток. В связи с этим, решено было выяснить, происходит линейродегенерация (НД) преимущественно в определенных нервных центрах мозга.97Анализ парафиновых срезов головы самцов показал, что основные очаги НД в тканинервного ганглия самцов sbr12/Dp(1;Y) в возрасте 3-5 суток располагаются в зрительных доляхмозга, причем особенно сильно затронута именно медулла (Рис.
44). Примечательно, что утаких самцов нарушение формирования медуллы сопровождается и возникновением очаговнейродегенерации. Это поднимает вопрос об избирательной чувствительности определенныхцентров к нейродегенерации, вызванной генетическими причинами.Обращают на себя внимание и значительные НД повреждения сетчатки – слояфоторецепторов (Рис. 44). Такой характер повреждения фоторецепторов и соответствующихпроводящих путей, пролегающих в нейропилях зрительных долей, в частности, в медулле –центре первичной переработки визуальных сигналов, – позволяет предполагать, что у самцовsbr12/Dp(1;Y) нарушено зрение.
Низкий уровень нейродегенерации у самцов других генотипов вэтом возрасте не позволил выявить в их мозге нервные центры, для которых было быхарактерно преимущественное расположение НД-повреждений.Помимо зрительных долей и сетчатки, в мозге самцов sbr12/Dp(1;Y) НД-изменениям взначительной мере подвержен антеннальный механосенсорный моторный центр – АММЦ,располагающийся на фронтальной стороне ганглия (Рис. 45).
В качестве контроля взяты самцыsbr+/Dp(1;Y), чтобы исключить эффект увеличения дозы гена sbr, самцы дикого типа Oregon-R,а также самцы L4/Dp(1;Y).Следует особо подчеркнуть, что именно АММЦ участвует в восприятии гравитации иформировании адекватной реакции организма на этот стимул, определяя отрицательныйгеотаксис (по: Matsuo and Kamikouchi, 2013). Тем не менее, у самцов L4/Dp(1;Y),характеризующихся снижением активности в тесте на ОГТ в возрасте 3-5 суток, мы не выявилисущественных НД-повреждений АММЦ в этом возрасте.
По-видимому, в основе сниженияактивности в тесте на ОГТ могут лежать разнообразные причины, среди которых и восприятиегравитации, и общее нарушение двигательной активности. Это может объяснять и выявляемуюразницу в интенсивности этих проявлений в зависимости от того, какой именно мутантныйаллель несут особи: снижение активности в тесте на ОГТ у самцов sbr12/Dp(1;Y) статистическизначимо выше, чем у самцов L4/Dp(1;Y) того же возраста (Рис. 32).98Рисунок 44.
Парафиновые срезы головы самца sbr12/Dp(1;Y) на уровне вееровидного тела (А) ипротоцеребрального моста (Б), окраска - гематокилином-эозином. Срез на уровне ВТ находится вофронтальной трети мозга, срез на уровне ПМ – в задней трети. Отверстия в ткани ганглиявизуализируются как округлые белые пятна и расположены преимущественно во внешней областизрительных долей (там расположены медулла и ламина) и в ретине (отмечены стрелками).
Масштабнаялинейка: 100 мкм.99Рисунок 45. Парафиновые срезы голов самцов различных генотипов на уровне латеральнойпридаточной доли (LAL) и вентрально-латерального протоцеребрума (VLP), окраска гематокилином-эозином. Увеличенная область отмечена пунктирным квадратом. Область АММЦотмечена пунктирным овалом. Стрелки указывают на отверстия в ткани мозга у самцов sbr12/Dp(1;Y).Масштабная линейка: слева – 100 мкм; в увеличенной области – 25 мкм.1003.3 Влияние аллеля sbr12 на процесс формирования зрительного пути уD. melanogasterНеслучайный характер локализации структурных дефектов и очагов нейродегенерации вмозге у самцов sbr12/Dp(1;Y) поднимает вопрос о механизмах, лежащих в основе этихнарушений и определяющих чувствительность к ним различных нервных центров мозга.Дефекты, выявленные нами, в основном, затрагивают структуру нейропилей – компартментов,образованных ветвящимися отростками нейронов. Особый интерес представляют структурныенарушения в зрительных долях мозга: в этой области и дефекты морфогенеза, и возникновениеочагов нейродегенерации выявляются в одних и тех же нервных центрах – медулле и ламине.Известно, что при формировании мозга в норме часть нейронов и/или отростков подвергаетсядегенерации в процессе оптимизации нейронных сетей, и этот процесс крайне важен дляформирования таких высокоупорядоченных структур, как медулла и ламина у D.
melanogaster(Yamaguchi and Miura, 2015a, 2015b).Характер организации медуллы у самцов sbr12/Dp(1;Y) позволил предположить, чтопричиной изменения внутренней архитектуры этого нейропиля может быть нарушениепроцесса нацеливания и/или арборизации аксонов фоторецепторных нейронов R7-R8. Вразвивающемся мозге аксоны этих нейронов служат источником навигационных сигналов,необходимых для навигации других нейронов, участвующих в формировании зрительного пути(Apitz and Salecker, 2014). Как следствие, нарушение расположения аксонов ФрН R7-R8 в медуллебудет приводить к дестабилизации процесса формирования зрительного пути в целом. АксоныФрН R1-R6 формируют ламину, а слои медуллы, обращенные в сторону ламины, формируютсяза счет терминальных участков аксонов ФрН R8, а затем R7 и сопутствующих им нейронов(Рис. 46) Именно эти два слоя медуллы оказываются наиболее структурно измененными воптических долях мозга у самцов sbr12/Dp(1;Y) (Рис.
44А, Б).Рисунок 46. Схема расположения окончаний аксонов фоторецепторных нейронов R1-R8 в медуллемозга имаго. Аксоны R1-R6 оканчиваются в ламине (зелёным), R8 (синим) и R7 (фиолетовым) – вмедулле (по: Gontang et al., 2011, с дополнениями)101Чтобы проследить за формированием аксонов фоторецепторных нейронов на болееранних этапах развития, мы провели анализ морфологии глазо-антеннального диска у самцов исамок различных генотипов.3.3.1 Нарушение фасцикуляции аксонов фоторецепторных нейронов в глазоантеннальном имагинальном диске у самцов sbr12/Dp(1;Y)У личинки третьего возраста тела фоторецепторных нейронов располагаются в глазнойчасти глазо-антеннального имагинального диска (ГАИД). Отростки ФрН, принадлежащихотдельным омматидиям, взаимодействуют друг с другом посредством белков клеточнойадгезии и формируют аксональные тракты, которые, в свою очередь, объединяются взрительный нерв, идущий от каждого ГАИД в соответствующую зрительную долюразвивающегося мозга (Meinertzhagen and Hanson, 1993; Clandinin and Zipursky, 2002).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
