Диссертация (1145638), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Схема скрещивания для получения самок, имеющих одну дозу гена sbr, и самцов,имеющих 2 дозы гена sbr.2.2 Исследование влияния аллеля sbr12 на локомоторную активность мухДля оценки влияния мутаций в гене sbr на поведение мух выбран тест на отрицательныйгеотаксис (ОГТ), поскольку было замечено, что самцы, несущие аллель sbr12 в гетерозиготе,большую часть времени проводят на дне сосуда, а не в верхней его части, как особи другихгенотипов.
Данный тест часто используется в лабораторной практике, поскольку позволяетоценить локомоторную активность мух (Feany and Bender, 2000; Ali et al., 2011; Nichols et al.,2012; Barone and Bohmann, 2013): после стряхивания на дно ёмкости, мухи инстинктивноползут вверх со скоростью, соответствующей уровню их локомоторной активности.Для проведения этого теста мух каждого генотипа помещали в вертикальные трубки (по20-25 штук в 1 трубке). После периода адаптации (1 минута) мух стряхивали на дно трубки,далее через 1 минуту, проводили учет мух: 1) сидящих на дне (неактивных), и 2) поднявшихсявыше отметки 10 см (активных).
Каждое тестирование проводили в 5 повторностях.Характеристики мух, взятых в эксперимент, приведены в Табл. 3. Тестирование мух каждогогенотипа проводили в четырёх возрастных категориях: 3-5 суток, 7-9 суток, 10-13 суток, 15-17суток.71Таблица 3. Характеристика экспериментальных групп особей D.melanogaster в тесте наотрицательный геотаксис.Генотипы*Количество дозгена Dm nxf1[в квадратных скобках даны обозначениягенотипов, используемые в тексте]sbr+ [Oregon-R](с учетом хромосомнойлокализации, указаннойв круглых скобках)1 доза (Х)sbr+/Dp(1;Y) v+y+2 дозы (X, Y)2001 доза (Y)200sbr12/ Dp(1;Y) v+y+2 дозы200[sbr12/Dp](sbr12 в X, sbr+ в Y)sbr+ [Oregon-R]2 дозы (Х, Х)200L4/sbr1 доза (Х)200sbr12/sbr+2 дозы (Х, Х)200СамцыОбъем выборки(в каждой из четырёхтестируемыхвозрастных категорий)200[sbr+/Dp]Df(1)vL4,ras mD/ Dp(1;Y)v+y+[L4/Dp]Самки+2.3 Исследование структуры мозга, глаз и характера локализации в них белка SBRу мух на различных стадиях развития2.3.1 Иммуногистохимическое окрашивание органовИммуногистохимическую окраску (ИГХ) применяли при изучении структуры мозга,глазо-антеннальных имагинальных дисков (ГАИД) и глаз на различных стадиях развитияD.
melanogaster, а также при изучении характера локализации белка SBR этих структурах. ИГХорганов D. melanogaster проводили по методу Хендерсона (Henderson, 2004), с изменениями.В работу были взяты следующие органы (в скобках указаны стадии развития мух):ГАИД (личинки 3-го возраста)Мозг (личинки 1-го и 3-го возрастов; имаго)Особей, взятых в эксперимент, отмывали от питательной среды. Фиксацию материалапроводили в 4% формальдегиде в течение 10 минут. Для этого у личинок 1 возраста - отсекаликутикулу на кончиках крайних сегментов с обоих концов тела, у личинок 3 возраста – отделялиголову на уровне 3-4 сегмента, у имаго – удаляли конечности и хоботок, чтобы обеспечить72доступ фиксатора к внутренним органам.
Далее фиксированный материал препарировали встандартном фосфатном буферном растворе (Phosphate Buffer Solution, PBS: 6 mM NaH2PO4, 6mM Na2HPO4, 150 mM NaCl; pH7.5), очищая нужные для эксперимента органы отсопутствующих тканей.Выделенные органы промывали в растворе PBST (0.1% Tween-20 в PBS) в течение 5минут. Пермеабилизацию проводили 3% раствором Tween-20 в PBS, не менее 3 часов прикомнатной температуре. Для блокирования неспецифического связывания использовали 10%раствор эмбриональной телячьей сыворотки, не менее 12 часов при +4°С. Затем проводилигибридизацию с антителами. Антитела разводили в блокирующем растворе.
Характеристикипервичных и вторичных антител, используемых в работе в различных сочетаниях, приведены вТабл. 4.Гибридизацию с каждым видом антител проводили в течение 12 часов при +4°С. Послекаждого акта гибридизации проводили отмывки в растворе PBST: 6 раз по 10 минут прикомнатной температуре.
Для визуализации ядер клеток использовали раствор флуоресцентногокрасителя нуклеиновых кислот DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, 4,6- диамидино-2фенилиндол), в концентрации 1 мкг/мл в PBS, предварительно проведя 2 отмывки по 10 минутв PBS при комнатной температуре. После окраски в растворе DAPI, отмывали 4 раза по 10минут в PBS при комнатной температуре.Дляприготовлениямикропрепаратовокрашенныеорганызаключаливсреду«VECTASHIELD Mounting Media» (Vector Laboratories, США) и накрывали покровнымстеклом.73Таблица 4.
Характеристики антител, используемых в работе.Название(в скобках указанфлуорохром – приналичии)Rabbit anti-SBRАнтигенС-терминальныйКратностьОписание и/илиразведенияисточник полученияфрагмент 1:50Ацапкина и др., 2010фрагмент 1:100Ацапкина и др., 2010белка SBRMouse anti-SBRС-терминальныйбелка SBRRat anti-ELAVБелок ELAV1:100DSHB, СШАMоuse anti-dFMR1Белок dFMR11:250Abcam, СШАnc-82Белок Bruchpilot.1:50DSHB, США(Маркируетпресинапсы.активныеЭтиантителаиспользуют для визуализациинейропиля мозга)Anti-HRPМетятуглеводныеостатки 1:300(GFP)гликопротеинов, что позволяетLaboratories, США;визуализироватьлюбезно предоставленымембраныJackson Immunoresearchнейронов (Jan et al., 1985)д.б.н.
C.В. СаранцевойAnti-Mouse IgGМышиный иммуноглобулин G 1:1000Invitrogen, США(AlexaFluor 546)(IgG)Anti-Rabbit IgGКроличий иммуноглобулин G 1:1000(AlexaFluor 633)(IgG).Anti-Rabbit IgGКроличий иммуноглобулин G 1:1000Invitrogen, США(AlexaFluor 647)(IgG).любезноInvitrogen, СШАпредоставленык.б.н. В.В. КозинымAnti-Rat IgGКрысиный иммуноглобулин G 1:1000Invitrogen, США;(AlexaFluor 488)(IgG).любезно предоставленык.б.н. С.Ю.
Сурковой742.3.2 Приготовление парафиновых срезов, окрашенных гематоксилином-эозиномПарафиновые срезы мозга имаго анализировали с целью выявления аномалий структурымозга и подсчета отверстий (пустот), представляющих собой очаги нейродегенеративныхповреждений мозга. Приготовление парафиновых срезов толщиной 5 мкм и их окраскугематоксилином-эозиномпроводилаС.И.Тимошенко(сотрудницалабораторииэкспериментальной и прикладной генетики ПИЯФ – Федерального государственногобюджетного учреждения «Петербургский институт ядерной физики им.
Б.П. Константинова»НИЦ «Курчатовский институт») по стандартной методике (Кисели, 1962).Мух обездвиживали при помощи эфирной наркотизации и насаживали на специальныеметаллические «воротнички» таким образом, чтобы их головы были ориентированы одинаковои находились бы в одной плоскости над плоскостью «воротничка». Фиксацию материала,дегидротацию, парафинизацию и заливку материала в парафин проводили, не снимая мух с«воротничков».Фиксацию материала проводили в 4% растворе формальдегида в PBS в течение сутокпри комнатной температуре. После окончания фиксации препараты отмывали в PBS 4 раза по30 минут.
Дегитротацию осуществляли этиловым спиртом: в концентрации 70% - 40 мин, 96% 30 мин, 100% -1 и 100%-2 - по 20 минут. Далее материал заливали метилбензиловым спиртом иоставляли на ночь. Для парафинизации материал инкубировали20 минв смесиметилбензилового спирта и парафина, затем последовательно инкубировали в четырёхрасплавах парафина по (40 минут в каждом). Далее проводили заливку материала в парафин.После отвердения парафина, парафиновые блоки с заключёнными в них головами мухснимали с «воротничков». Далее готовили полутонкие (толщиной 5 мкм) серийные срезы головмух при помощи микротома.
Серийные срезы голов переносили на предметные стёкла,покрытые поли-L-лизином или яичным белком (для предотвращения отслаивания срезов припоследующей окраске).Для подготовки срезов к окраске гематоксилином-эозином проводили депарафинизациюв двух сменах ксилола по 3-5 минут, затем гидротацию срезов: сперва в двух сменах 96%этилового спирта, затем в 70% этиловом спирте, затем в дистиллированной воде – по 3-5 минутна каждом этапе.Окраску гематоксилином проводили в течение 1,5-2 минут при комнатной температуре,затем стёкла с окрашенными срезами окунали в солянокислый спирт и промывали в чутьтеплой проточной воде, чтобы получить синий оттенок окраски ядер клеток.
Затем препаратыпромывали в дистиллированной воде и окрашивали эозином в течение 1-2 мин при комнатнойтемпературе. Далее препараты последовательно инкубировали в 70% и 96% этиловом спирте по751,5 мин, затем – на 2 мин помещали в карбон-ксилол, после этого – по 2-5 мин инкубировали вдвух сменах ксилола.Готовые препараты срезов голов мух заключали в канадский бальзам и накрывалипокровными стёклами.2.3.3 Микроскопический анализ препаратовАнализпрепаратовпроводилисиспользованиемлазерногосканирующегоконфокального микроскопа Leica TCS SP5 («Leica Microsystems GmbH», Германия) в Центреколлективного пользования СПбГУ «Хромас» и лазерного сканирующего конфокальногомикроскопа Leica TCS SP5 («Leica Microsystems GmbH», Германия) на базе лабораториирадиационной биохимии МРНЦ им.
А.Ф. ЦЫБА - филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии»Минздрава России, г. Обнинск.Условия сканирования препаратов, окрашенных при помощи DAPI и антител: для DAPI– возбуждающий лазер 405 нм, запирающий фильтр 425-475 нм; для флуорохромаAlexaFluor488 и GFP – возбуждающий лазер 488 нм, запирающий фильтр 498-540 нм; дляAlexaFluor546 – возбуждающий лазер 534 нм, запирающий фильтр 544-590 нм; дляфлуорохромов AlexaFluor633 и AlexaFluor647 – возбжудающий лазер 635 нм, запирающийфильтр 645-590 нм.Для визуализации отростков фоторецепторов в мозге имаго проводили детекциюавтофлуоресценции при следующих параметрах сканирования: возбуждающий лазер 488 нм,запирающий фильтр 530-580 нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
