Диссертация (1145638), страница 16
Текст из файла (страница 16)
При таких параметрах сканирования автофлуоресценциябелков-родопсинов в отростках фоторецепторов хорошо заметна, несмотря на присутствиефоновой автофлуоресценции тканей у D. melanogaster.Для детального анализа структуры нейропилей медуллы и ламины (выявления ячеистойструктуры, образованной картриджами отростков), проводили детекцию автофлуоресценции напарафиновыхсрезах,окрашенныхгематоксилином-эозином.Такойподходпозволилиспользовать одновременно преимущества обоих методов: и сохранение структуры ткани,присущее парафиновым срезам, и возможность детектировать сигнал не на всей толщепарафинового среза (как в случае использования световой и обычной флуоресцентноймикроскопии), а в конкретном оптическом срезе за счет использования лазерногосканирующего конфокального микроскопа.
В результате были получены изображения,отражающие внутреннюю архитектуру ламины и медуллы имаго с высоким разрешением.Серии оптических срезов были получены с шагом 0.5-1 μм по оси z. Обработкуполученных изображений проводили, используя системы компьютерного анализа изображений:76LAS AF Lite V1.7.0 («Leica Microsystems GmbH», Германия) и ImageJ, а также программу AdobePhotoshop V7.0 (Adobe Systems Incorporated, США) для компоновки составных рисунков инанесения поясняющих отметок (стрелок, контуров) для упрощения восприятия материала.2.4 Статистическая обработка результатовДля статистической обработки полученных результатов использовали следующиепрограммы: Statistica v.13.3 (TIBCO Software Inc.), Microsoft Office Excel 2003 (MicrosoftCorporation).Статистическую значимость отличий по параметрам активности в тесте на ОГТ междусамцами различных генотипов, самками различных генотипов, а также между самцами исамками сходных генотипов, проверяли помощи непараметрического критерия КраскелаУоллиса для множественных сравнений.
В случае выявления статистически значимых отличий(р<0.01), тестируемые группы сравнивали попарно, используя непараметрический U-критерийМанна-Уитни (р<0.01). Доверительный интервал для долей вычисляли для p<0.01.Аналогично проверяли статистическую значимость отличий при сравнении долиповреждённой ткани мозга у самцов и самок различных генотипов. В каждый анализ быловзято по 5 мозгов мух каждого генотипа; эксперимент проводился в 3 повторностях.
Длякаждого мозга определяли долю поврежденной ткани (в % от его объёма), анализируя серийныемикрофотографии парафиновых срезов при помощи программы для анализа изображенийImageJ. Анализ полученных данных проводили с использованием непараметрическихкритериев: критерия Краскела-Уоллиса и U-критерия Манна-Уитни (p<0.05).Для оценки интенсивности снижения двигательной активности у мух различныхгенотипов применяли регрессионный анализ, доступный в программе Statistica v.13.3 (TIBCOSoftware Inc.).Визуализацию данных осуществляли с использованием столбчатых гистограмм наоснове полученных средних значений тестируемых показателей.
На гистограммах указывалидоверительный интервал для соответствующего уровня статистической значимости.773 РЕЗУЛЬТАТЫ3.1 Влияние гена sbr на поведение самцов и самок D. melanogasterРанее мы показали, что у самцов sbr12/Dp(1;Y) нарушены брачное поведение и общаяподвижность (Касаткина, 2007; Ацапкина и др., 2010). Поскольку аллель sbr12 в гомо- игемизиготе летален, самцов-носителей аллеля sbr12 можно получить путем скрещивания самокsbr12/FM6 с самцами L4/Dp(1;Y), несущими аллель sbr+ в Y-хромосоме в составе дупликацииDp(1;Y)y+v+ (см. раздел Материалы и методы, п. 2.1). Среди тестов, оценивающих общуюдвигательную активность, часто используют тест на отрицательный геотаксис (ОГТ) (Feany andBender, 2000; Ali et al., 2011; Nichols et al., 2012; Barone and Bohmann, 2013). ОГТ, которыйхарактерен для взрослых особей D.
melanogaster, проявляется в стремлении перемещаться внаправлении, противоположном вектору гравитации. Таким образом, после стряхивания на дноёмкости, мухи инстинктивно ползут вверх со скоростью, соответствующей уровню ихлокомоторной активности. Поэтому тест на ОГТ может служить инструментом для оценкипоказателя подвижности самцов, несущих аллель sbr12 в гетерозиготе, в сравнении с этимпоказателем у особей другого генотипа.У самцов sbr12/Dp(1;Y) нарушения подвижности можно наблюдать без тестирования:большую часть времени мухи проводят на дне ёмкости и практически не перемещаются, но дляколичественной оценки параметров локомоторной активности необходимо было провеститестирование.
Для этой цели мы выбрали тест на ОГТ. Чтобы ответить на вопрос, зависит липроявление аллеля sbr12 от пола особи, тестированию подвергали и самок sbr12/sbr+, которые, напервый взгляд, не отличаются по подвижности от самок дикого типа. Способность котрицательному геотаксису оценивали, определяя долю "активных" мух - способных поднятьсявыше отметки 10 см, и "неактивных" - остающихся на дне спустя 1 минуту после стряхиванияна дно сосуда. Мухи, проявляющие активность в данном тесте, характеризуются нормальнойспособностью к ОГТ и подвижностью, а "неактивные" (остающиеся на дне) - утратилиспособность к ОГТ.
Помимо этих "крайних" вариантов, по которым проводили статистическуюобработку полученных результатов, среди мух каждого тестированного генотипа были особи,проявляющие промежуточную активность в тесте на ОГТ: они поднимались вверх по стенкесосуда, но не достигали тестовой отметки 10 см. Этот показатель мы рассматривали как нормуреакции каждого генотипа.783.1.1 Влияние аллеля sbr12 на отрицательный геотаксис у самцов и самокD. melanogasterПервоначально в эксперимент были взяты самцы и самки различных генотипов ввозрасте 3-5 суток.
У мух в этот период времени уже полностью сформированы все нервныецентры мозга (Martin-Pena et al., 2014), что исключает возможное влияние недоразвитияопределенных нервных центров на способность к ОГТ.Присутствие мутации sbr12 в гетерозиготном состоянии приводит к значительномуповышению доли неактивных особей (для p<0.01, Рис. 30): среди самцов, несущих мутантныйаллель sbr12, около 30% особей остаются на дне сосуда в течение 1 мин после стряхивания. Усамцов других генотипов этот показатель значительно ниже: на дне остаются около 2% самцовOregon-R, около 5% самцов sbr+/Dp(1;Y) и около 15% самцов L4/Dp(1;Y).Сравнивая самцов Oregon-R и sbr+/Dp(1;Y), следует отметить, что увеличение дозы генаsbr не приводит к значительным изменениям активности мух в тесте на ОГТ: они статистическизначимо не отличаются по доле активных особей (p=0,48), при этом, доля неактивных особейвыше у самцов sbr+/Dp(1;Y) (p<0,01) согласно критерию Манна-Уитни (Рис.
30). Изменениехромосомной локализации аллеля sbr+ у самцов L4/Dp(1;Y), у которых единственный аллельsbr+ находится в составе Y-хромосомы, снижает долю активных и повышает долю неактивныхособей в тесте на ОГТ при сравнении этой группы самцов с самцамиOregon-R или+sbr /Dp(1;Y).В то же время, у самцов sbr12/Dp(1;Y), несущих 2 дозы гена sbr: мутантный аллель sbr12 вХ-хромосоме и аллель дикого типа sbr+ в Y-хромосоме, активность в тесте на ОГТ значительнониже, чем у самцов L4/Dp(1;Y), у которых в Х-хромосоме - делеция гена sbr, а единственныйаллель sbr+, как и у самцов-носителей аллеля sbr12, локализуется в Y-хромосоме.
Этирезультаты свидетельствуют о доминантно-негативном эффекте аллеля sbr12, присутствиекоторого нарушает активность в тесте на ОГТ у самцов в большей степени, чем присутствиенулевого аллеля, на фоне аллеля sbr+ в Y-хромосоме. Более низкая активность самцовL4/Dp(1;Y) при их сравнении с самцами дикого типа предполагает, что аллель sbr+ в Yхромосоме, компенсируя летальный эффект нулевого аллеля гена sbr (делеции L4) в Ххромосоме, не является функционально идентичным аллелю sbr+, локализованному в Ххромосоме.79Рисунок 30.
Показатели активности самцов D. melanogaster в возрасте 3-5 суток в тесте на ОГТ взависимости от генотипа. Самцы sbr12/Dp(1;Y) и L4/Dp(1;Y) статистически значимо отличаются друг отдруга и от самцов остальных тестированных генотипов согласно U-критерию Манна-Уитни (p<0.01).Аналогичному тестированию подвергли и самок: в эксперимент по оценке активности втесте на ОГТ были взяты самки 3 генотипов: дикого типа, гетерозиготные по аллелю sbr12, инесущие одну дозу нормального аллеля sbr+.
Результаты эксперимента представлены наРис. 31.Рисунок 31. Показатели активности самок D. melanogaster в возрасте 3-5 суток в тесте на ОГТ взависимости от генотипа. Cамки трёх исследованных генотипов в возрасте 3-5 суток не отличаютсядруг от друга по показателям активности в тесте на ОГТ.Согласно результатам, в возрасте 3-5 суток самки трёх исследованных генотипов неотличаются статистически значимо друг от друга по параметрам активности в тесте на ОГТ.Примечательно, что наличие аллеля sbr12 в гетерозиготе у самок, в отличие от самцов, неприводит к снижению способности к ОГТ в возрасте 3-5 суток. Возникает вопрос, почемумутантный аллель sbr12 влияет на подвижность самцов и не оказывает такого влияния на самок.80Возможно, негативное влияние мутантного аллеля sbr12 у гетерозиготных самок sbr12/sbr+компенсируется аллелем дикого типа sbr+, находящимся в привычной для него локализации – вХ-хромосоме.
В то же время, негативное влияние мутантного аллеля sbr12 у самцовsbr12/Dp(1;Y) может не компенсироваться (либо компенсироваться не полностью) аллелемдикого типа sbr+, находящимся в непривычной для него локализации – в Y-хромосоме.Присутствие мутантного аллеля у самок может проявиться по мере их старения.
В поискахответа на вопрос, влияет ли возраст на проявление аллеля sbr12, мы проанализировалиизменения активности в тесте на ОГТ в зависимости от возраста мух.3.1.2 Влияния аллеля sbr12 на возрастную динамику активности самцов и самокD. melanogaster в тесте на отрицательный геотаксисВ тест на ОГТ были взяты самцы и самки 3 дополнительных возрастных групп: 7-9суток, 11-13 суток и 15-17 суток. Особей в возрасте более 17 суток не тестировали, посколькубольшинство самцов sbr12/Dp(1;Y), характеризующихся наиболее выраженным проявлениемаллеля sbr12, к этому времени погибает.Оценка активности самцов в зависимости от их возраста (Рис. 32) не выявиластатистически значимых различий между самцами дикого типа (линия Oregon-R) и самцамиsbr+/Dp(1;Y) за весь период наблюдения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
