Диссертация (1145638), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Для выявления структурных дефектов функциональных центров мозга иопределения их природы использована методика приготовления тонких парафиновых срезов всовокупности с конфокальной микроскопией целого мозга самцов и самок D. melanogasterразличных генотипов с последующим анализом препаратов.3.2.1 Анализ структуры мозга у самок и самцов в зависимости от генотипа3.2.1.1 Присутствие аллеля sbr12 в гетерозиготе приводит к возникновениюструктурных дефектов мозга у самцов D. melanogasterВ работу были взяты самцы D.
melanogaster 4 различных генотипов в возрасте 3-5 суток- в этот период времени все нервные центры мозга уже полностью сформированы (Martin-Penaetal.,2014),аестественныефизиологическиевозрастныеизменения(например,нейродегенеративные процессы в мозге) в норме не выявляются.В ходе исследования, среди самцов D. melanogaster, отличающихся друг от друганаличием/отсутствием аллеля sbr12, изменением дозы гена sbr и хромосомной локализациейаллеля sbr+, только у самцов sbr12/Dp(1;Y) выявлены существенные нарушения структурыэллипсоидного тела (ЭТ) - одного из главных нервных центров в мозге дрозофилы, и медуллы одного из нейропилей зрительных долей.ЭТ у дрозофилы обладает характерной формой, позволяющей легко идентифицироватьэтот нервный центр в мозге.
На изображениях, полученных при помощи конфокальноймикроскопии (Рис. 35), видно, что у самцов всех исследуемых генотипов, за исключениемsbr12/Dp(1:Y), тела клеток, ограничивающих ЭТ, располагаются по окружности. У самцовsbr12/Dp(1:Y) структура ЭТ изменена настолько, что его идентификация в мозге крайнезатруднена. В таких случаях оптический срез, соответствующий местоположению ЭТ,выбирали, ориентируясь на взаимное расположение других нервных центров мозга.87Рисунок 35. Контур эллипсоидного тела (ЭТ) у самцов-имаго D. melanogaster различныхгенотипов. Верхний ряд - фрагменты оптических срезов, прошедших через ЭТ, нижний ряд - те жефотографии с отмеченным пунктирной линией контуром ЭТ.
Идентифицировать контур ЭТ у самцовsbr12/Dp(1:Y) без специальных маркеров не представляется возможным. Ядра клеток окрашены DAPI.Масштабная линейка: 50 мкм.В основе изменения структуры ЭТ у самцов sbr12/Dp(1:Y) могут лежать нарушенияморфогенеза этого нервного центра, а также нейродегенеративные процессы, начавшиеся послезавершения или в процессе его формирования. Известно, что ЭТ сформировано ветвящимисяотростками соответствующих нейронов, и нарушение арборизации и/или нацеливания ихотростков приводит к возникновению дефектов структуры ЭТ (Boquet et al., 2000a,b; Strauss,2002; Young and Armstrong, 2010b; Tran et al., 2013). В то же время, при формировании нервнойсистемы в норме происходит программируемая клеточная гибель (Yamaguchi and Miura, 2015a),и этот процесс может идти с большей интенсивностью у мутантных особей.
Если группа клетокпогибает в каком-то отделе мозга, на месте погибших клеток образуются пустоты (вакуоли) изза ограниченного пролиферативного потенциала нервных клеток. Это позволяет оцениватьуровень дегенеративных процессов в нервном ганглии в целом и в отдельных его районахпутем анализа парафиновых срезов мозга у дрозофилы.Анализ парафиновых срезов показал, что у самцов sbr12/Dp(1:Y) нарушена структуранейропиля эллипсоидного тела - пространства, занятого отростками нейронов ЭТ. У такихсамцов ЭТ выявляется в виде отдельных фрагментов вместо характерного тора (Рис.
36). В тоже время, характерных для нейродегенерации отверстий в области ЭТ мы не обнаружили.Полученные результаты свидетельствуют о том, что в основе изменения структуры ЭТ у самцовsbr12/Dp(1:Y) лежит нарушение морфогенеза этого нервного центра.88Рисунок 36. Структура эллипсоидного тела у самцов различных генотипов. Окраска срезов гематокилин-эозином. Верхний ряд - фрагменты парафиновых срезов, прошедших через эллипсоидноетело мозга. Нижний ряд - те же изображения, контур ЭТ отмечен пунктирной линией.
Только у самцовsbr12/Dp(1:Y) эллипсоидное выявляется в виде фрагментов, у самцов остальных генотипов ЭТвыявляется в виде тора ("бублика"). Масштабная линейка: 50 мкмЕще одним типом нарушений, отличающим самцов sbr12/Dp(1;Y) от самцов другихисследованныхгенотипов,являютсяаномалиизрительныхдолеймозга.Сравнениепарафиновых срезов зрительных долей мозга самцов различных генотипов (Рис. 37),дополненное результатами конфокальной микроскопии (Рис. 38, 39), позволило установитьхарактер нарушений структуры данного отдела мозга.На парафиновых срезах отчетливо видно, что у самцов sbr12/Dp(1;Y) нарушена структурамедуллы (Рис.
37) - одного из функциональных центров зрительных долей. Как и в случае с ЭТ,в медулле у самцов sbr12/Dp(1;Y) наблюдаются дефекты как формы нейропиля, так и характерарасположения соответствующих нейронов. Так, у самцов sbr+/Dp(1;Y), L4/Dp(1;Y) и Oregon-Rкрая медуллы ровные, а тела нейронов расположены рядами по периферии нейропиля. Усамцов sbr12/Dp(1;Y) медулла имеет несколько "лепестков", более того, несмотря на раннийвозраст, на срезах их мозга выявлены отверстия, характерные для нейродегенерации.89Рисунок 37. Структура зрительных долей мозга самцов D.
melanogaster различных генотипов.Окраска срезов - гематокилин-эозином. Верхний ряд - фрагменты парафиновых срезов зрительныхдолей. Нижний ряд - те же изображения, контур медуллы отмечен пунктирной линией. Стрелкойотмечена зона с признаками нейродегенерации. Ло - лобула, Ме - медулла. Масштабная линейка: 100мкм.Для более глубокого понимания характера нарушения структуры медуллы у самцов12sbr /Dp(1;Y), мы провели трехмерное сканирование зрительных долей мозга, применивиммуногистохимическоеокрашиваниеприпомощиспецифическихантителnc82,маркирующих нейропиль.
Для контроля были взяты самцы sbr+/Dp(1;Y). Результатытрехмерного сканирования зрительных долей самцов sbr+/Dp(1;Y) и sbr12/Dp(1;Y) представленына Рис. 38 и Рис. 39, соответственно. Оказалось, что наблюдаемые у самцов sbr12/Dp(1;Y)"лепестки" медуллы представляют собой выпуклые объемные выпячивания ткани оптическойдоли, выдающиеся за пределы его поверхности (Рис.
39, отмечены стрелками). В зрительныхдолях мозга самцов sbr+/Dp(1;Y) никаких структурных аномалий мы не выявили (Рис. 38).90Рисунок 38. Результаты сканирования зрительной доли нервного ганглия самца sbr+/Dp(1;Y). Ядраклеток окрашены при помощи DAPI (голубой). Антитела nc82 (сиреневый) маркируют нейропиль.Пунктиром отмечены границы нейропилей. Ло – лобула, Лп – лобулярная пластинка, Ме – медулла. Zn –позиция по оси Z, шаг 5 мкм. Z0 – начальная позиция, соответствующая поверхности зрительной доли.Масштабная линейка: 100 мкм.91Рисунок 39. Результаты сканирования зрительной доли нервного ганглия самца sbr12/Dp(1;Y).
Ядраклеток окрашены при помощи DAPI (голубой). Антитела nc82 (сиреневый) маркируют нейропиль.Пунктиром отмечены границы нейропилей. Ло – лобула, Лп – лобулярная пластинка, Ме – медулла. Zn –позиция по оси Z, шаг 5 мкм. Z0 – начальная позиция, соответствующая поверхности зрительной доли.Стрелки указывают на аномалии структуры медуллы. Масштабная линейка: 100 мкм.92Примечательно, что оба метода исследования - и анализ парафиновых срезов с помощьюсветовой микроскопии, и анализ внутренней архитектуры мозга при помощи конфокальноймикроскопии, - выявили дефекты структуры ЭТ только у самцов sbr12/Dp(1;Y).
У самцов другихгенотипов, взятых в анализ, структурные дефекты ЭТ и зрительных долей не выявлены ниодним из использованных методов. Таким образом, только присутствие аллеля sbr12 оказываетдоминантно-негативный эффект, вызывая нарушения морфогенеза ЭТ и медуллы зрительныхдолей у самцов sbr12/Dp(1;Y).Наличие аномалий развития мозга у самцов sbr12/Dp(1;Y), с одной стороны, можетобъяснять снижение их активности в тесте на ОГТ, наблюдаемое уже в возрасте 3-5 суток, ианомальное брачное поведение.
В то же время, отсутствие аналогичных структурных дефектовмозга у самцов L4/Dp(1;Y), для которых характерно меньшее снижение способности к ОГТ,прогрессирующее по мере взросления особей, предполагает, что в основе снижения этойспособности могут лежать и другие факторы, например, нейродегенеративные повреждениямозга.3.2.1.2 Присутствие нулевого аллеля L4 и аллеля sbr12 в гетерозиготе не оказываетзаметного влияния на структуру мозга самок D.
melanogasterАналогичная работа проведена с самками D. melanogaster, отличающимися друг от друганаличием/отсутствием аллеля sbr12 и дозой аллеля sbr+. Как и в случае с самцами, в работубыли взяты самки в возрасте 3-5 суток.У самок всех тестированных генотипов мы не выявили каких-либо структурныхдефектов мозга.
Эллипсоидное тело (Рис. 40) и зрительные доли (Рис. 41) у самок sbr12/sbr+ исамок L4/sbr+ не отличалась по структуре от таковых у самок дикого типа (линия Oregon-R). ЭТу самок всех тестированных генотипов имеет форму тора ("бублика"), а нейропили зрительныхдолей, включая медуллу - фасолевидной формы с ровными четкими краями без каких-либовыпячиваний и инвагинаций.Полученные результаты свидетельствуют о том, что ни носительство аллеля sbr12 (вслучае самок sbr12/sbr+), ни уменьшение дозы гена sbr (в случае самок L4/sbr+) не оказывает усамок существенного влияния на формирование ЭТ и медуллы зрительных долей функциональных центров, морфогенез которых нарушен у самцов sbr12/Dp(1;Y).
Такимобразом, влияние аллеля sbr12 на морфогенез ЭТ и медуллы проявляется только у самцов, а усамок sbr12/sbr+ компенсируется присутствием аллеля дикого типа sbr+ в гомологичной Ххромосоме. У самцов sbr12/Dp(1;Y) такой компенсации не происходит.93Рисунок 40. Структура эллипсоидного тела у самок различных генотипов. Окраска срезов гематокилин-эозином. Вверху: фрагменты парафиновых срезов, прошедших через эллипсоидное теломозга. Нижний ряд - те же срезы с отмеченным пунктирной линией контуром ЭТ. У самок всехтестированных генотипов структура ЭТ сохранена: ЭТ выявляется в виде тора ("бублика").
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
