Диссертация (1145638), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Такой подход позволяет исследовать структуру нейропилеймедуллы и ламины с бóльшим разрешением, чем это возможно при использовании световоймикроскопии. Результаты сканирования парафиновых срезов на уровне ламины и медуллыпредставлены на Рис. 53 и 54, соответственно.Анализ внутренней архитектуры ламины показал, что у самцов дикого типа (линияOregon-R), а также у самцов sbr+/Dp(1;Y) и L4/Dp(1;Y), в ламине выявляется характернаяячеистая структура, каждая ячейка которой соответствует отдельному картриджу отростков.Картриджи в ламине таких самцов четко видны и расположены упорядоченно.
У самцовsbr12/Dp(1;Y) ламина менее упорядочена, а структура картриджей выглядит более размытой(Рис. 53).Детальный анализ структуры медуллы показал, что у самцов sbr12/Dp(1;Y) нарушена нетолько архитектура коннектома этого нейропиля, но и граница между медуллой и ламиной(Рис. 54). Существование в медулле у таких самцов областей, в которых картриджи невыявляются, свидетельствует о нарушении у них формирования коннектома.
Причина этихдефектов, по-видимому, кроется в нарушении нацеливания аксонов: известно, что в роли«пионерных» нейронов при формировании зрительного нервного пути в медулле выступаютфоторецепторные нейроны R7 и R8. Аксоны этих нейронов первыми приходят в медуллу ислужат навигационным ориентиром дляаксонов другихнейронов,участвующихвформировании картриджей (по: Apitz and Salecker, 2014).Аномальная структура границы между медуллой и ламиной, наблюдаемая у самцовsbr12/Dp(1;Y), также указывает на нарушение нацеливания аксонов нейронов: такой характерструктуры границы указывает на то, что некоторые аксоны нейронов, которые должны былиоканчиваться в ламине, не нашли там свои мишени и проросли глубже - в медуллу.Некоторое снижение количества картриджей в медулле самцов L4/Dp(1;Y) (Рис. 54)является ожидаемым и соответствует выявленному у них снижению количества окончанийаксонов фоторецепторных нейронов R7-R8 в медулле (Рис.
52). Примечательно, что, в отличиеот самцов sbr12/Dp(1;Y), структура ламины у самцов L4/Dp(1;Y) не имеет видимых нарушений(Рис. 53), а картриджи в медулле (Рис. 54) и ламине (Рис. 53) расположены упорядоченно.110Рисунок 53. Внутренняя архитектура нейропиля ламины в мозге самцов-имаго различныхгенотипов. А – общий вид мозга на парафиновых срезах голов, прошедших перпендикулярноориентации картриджей ламины. Отмеченные рамками фрагменты ламины увеличены (представлены напанели Б).
Срезы окрашены гематоксилином-эозином. Б - детальные изображения структуры ламины,полученые при помощи конфокальной микроскопии за счет детекции флуоресценции гистологическихкрасителей (зеленым). Стрелки указывают на отдельные картриджи. У самцов sbr12/Dp(1;Y) структураламины менее упорядочена (отмечено знаком вопроса). Масштаб: А – 75 мкм, Б – 25 мкм.111Рисунок 54. Внутренняя архитектура нейропиля медуллы в мозге самцов-имаго различныхгенотипов. А – общий вид мозга на парафиновых срезах голов, окрашенных гематоксилином-эозином.На каждом срезе выделена рамкой область медуллы, в которой плоскость среза прошлаперпендикулярно ориентации картриджей. Б увеличенные изображения участков медуллы, выделенныхрамками на панели А.
Изображения получены при помощи конфокальной микроскопии за счет детекциифлуоресценции гистологических красителей (зеленым). В – детальные изображения структуры медуллысамцов sbr12/Dp(1;Y) с условными отметками, показывающими нарушение структуры границы междумедуллой и ламиной (вверху, граница показана белыми точками) и аномалиями формированиякартриджей (внизу, картриджи отмечены желтыми звездочками, зона без карриджей – стрелкой).Масштаб: А – 75 мкм, Б – 25 мкм.1123.4 Особенности распределения белка SBR в развивающемся мозге у личинокD. melanogasterДефекты формирования определенных нервных центров в мозге самцов, несущих аллельsbr12 в гетерозиготе, поднимают вопрос о механизмах, лежащих в их основе. Такие нарушенияневозможно объяснить одним лишь снижением общего уровня экспорта мРНК в результатенарушенияуниверсальнойфункции–ядерно-цитоплазматическогоэкспортамРНК,осуществляемого белком SBR.
В противном случае, дефекты структуры мозга затрагивали быне преимущественно определенные нервные центры, а распределялись бы в мозгеравномерно. В пользу предположения о существовании специализированной функции гена sbr(Dm nxf1) в нервной системе свидетельствует и то, что у мутанта sbr10 (l(1)ts403) нарушеныпараметры долговременной памяти (Никитина и др., 2003б), а у гемизигот по аллелям sbr5, sbr6,sbr12, sbrmgln и L4 - нацеливание аксонов (Korey et al., 2001). Для проверки предположения о том,может ли белок SBR выполнять специализированные функции в цитоплазме в составекомплексов РНП, участвуя в биогенезе долгоживущих мРНК, мы проанализировали характерлокализации этого белка в клетках мозга в динамике личиночного развития. Поскольку процессформирования нервных центров мозга имаго начинается в период развития личинки, именноличиночный этап онтогенеза был выбран нами для исследования характера локализации белкаSBR в развивающемся мозге.3.4.1 Зональное распределение белка SBR в развивающемся мозге личинокD.
melanogaster.В нервном ганглии дрозофилы на стадии личинки первого возраста белок Dm NXF1распределен не равномерно, а в виде зон преимущественной локализации. Такие зоны образуютактивные нейробласты (вторичные нейробласты) и ближайшие к ним клетки – вероятно, ихвновь образованные потомки (Рис. 55). В этих зонах белок Dm NXF1 присутствует не только вядрах и вблизи ядерной оболочки клеток, но главным образом выявляется в виде крупныхгранул в цитоплазме.113Рисунок 55. Характер локализации белка SBR в полушарии мозга личинки 1-го возраста D.melanogaster дикого типа.
А – полушарие мозга; Б – увеличенная область, выделенная в прямоугольникна панели А. Стрелки указывают на крупные клетки - вышедшие из периода покоя нейробласты, вцитоплазме которых присутствует белок SBR в виде крупных гранул (отмечены головками стрелок).Масштаб: на панели А - 20 мкм, на панели Б – 5 мкм.На стадии личинки 3 возраста белок SBR в нервном ганглии тоже распределеннеравномерно (Рис.
56А). Как и в нервном ганглии личинок 1 возраста, богатые белком SBRзоны образуют вторичные НБ и их дочерние клетки. Однако, в отличии от ганглия личинкипервого возраста, белок SBR обогащает не все, а только некоторые НБ и образованные имиклеточные линии (Рис. 56Б). Интересно, что если в цитоплазме НБ белка SBR мало, то и егодочерние клетки обеднены этим белком, и наоборот (Рис. 56Б).
Следует отметить, что каждыйнейробласт у дрозофилы уникален, имеет свой паттерн экспрессии генов и образуетопределенное количество потомков определенного типа (Urbach and Technau, 2003; Egger et al.,2008). По-видимому, белок SBR проявляет специфичность не ко всем, а только к некоторымклеточным линиям, что согласуется с фенотипическим проявлением аллеля sbr12 у самцов: в ихмозге нарушена структура, преимущественно, определенных нервных центров.114Рисунок 56. Характер локализации белка SBR в полушарии мозга самца D. melanogaster дикоготипа на стадии личинки 3-го возраста.
А – полушария мозга; Б – увеличенная область, выделенная впрямоугольник на панели А. Короткие стрелки указывают на клеточную линию, бедную белком SBR,длинные – на богатую этим белком. Головкой стрелки отмечены формирующиеся вторичныеаксональные тракты. Звездочкой отмечен нейробласт, богатый белком SBR, точкой – нейробласт,бедный данным белком.
Масштаб: панель А - 100 мкм, панель Б – 20 мкм.Важно отметить, что вне зависимости от того, обогащены ли клеточные линиисоответствующего нейробласта белком SBR, этот белок маркирует их формирующиесявторичные аксональные тракты (Рис 56Б, головки стрелок). Локализация белка SBR в зонеформирования вторичных аксональных трактов указывает на то, что этот белок может бытьважен для формирования отростков нейронов.3.4.2 Белок SBR присутствует в виде гранул в отростках нейроновПрисутствие белка SBR в виде гранул в цитоплазме клеток позволяет предполагать, чтофункции этого белка выходят за рамки ядерно-цитоплазматического экспорта мРНК, покрайней мере, в нервной системе.
Мы предположили, что белок SBR, в отличие от белка NXF1млекопитающих и подобно его паралогам – белкам NXF2, NXF7 и NXF5, может сохранятьсвязь с определёнными мРНК в цитоплазме клеток. В этом случае, белок SBR может входить всостав транспортных РНП-гранул, присутствующих как в теле, так и в отростках нервныхклеток. Для проверки этого предположения, мы провели иммуногистохимическое окрашиваниемозга личинок, используя специфические антитела к белкам SBR и dFMR1 (Fragile X Mental115Retardation1).БелокdFMR1уD. melanogasterявляетсяортологомбелкаFMRPмлекопитающих, связывает определённые мРНК и выявляется в составе нейрональныхтранспортных РНП-гранул(Barbee et al., 2006; Zalfa et al., 2006).
Непосредственноевзаимодействие с белком FMRP показано для белка NXF2 в нейронах мыши (Lai et al., 2006).Результаты эксперимента показали, что в нейронах белки SBR и dFMR1 выявляются ввиде гранул, причем не только в теле клетки, но и в отростках (Рис. 57А). Интересно, чтоданные белки обнаруживаются в гранулах как вместе, так и раздельно (Рис. 57Б).Рисунок 57. Гранулы, содержащие белки SBR и dFMR1 в отростках нейронов мозга личинки D.melanogaster 1-го возраста. А.
Нейроны мозга личинки D. melanogaster; Б. Увеличенный фрагментизображения, отмеченный рамкой на панели А. Ядра клеток окрашены при помощи DAPI, белки SBR,dFMR1 и ELAV (маркирует ядра нейронов) – при помощи соответствующих антител. Стрелкамипоказаны гранулы, содержащие белок SBR; головками стрелок – гранулы, содержащая белок dFMR1.Масштаб: панель А – 10 мкм, панель Б – 1 мкм.Существование гранул, в которых выявляются оба эти белка, указывают на то, что белокSBR входит в состав РНП-гранул и, по-видимому, участвует в цитоплазматическом транспортемРНК по отросткам нейронов.
Наличие же гранул, содержащих только белок dFMR1, илитолько белок SBR, свидетельствует о том, что у белка SBR, как и у белка dFMR1, естьспецифические мРНК-мишени в цитоплазме. В противном случае, белок SBR выявлялся бы во116всех гранулах, содержащих белок dFMR1. Гранулы, обнаруживающие присутствие толькобелка SBR, по-видимому, являются РНП-гранулами, не содержащими мРНК, для транспортакоторых необходим белок dFMR1.Таким образом, наличие белков SBR и dFMR1 в составе одной и той же гранулыподтверждает предложенную нами гипотезу о роли белка SBR (Dm NXF1) в транспорте мРНКпо отросткам нейронов.
Существование гранул, содержащих только один из этих белков,позволяет предполагать участие белка SBR в цитоплазматической судьбе не всех, а тольконекоторых долгоживущих мРНК.Формирование нервных центров определяется направленным ростом отростков нервныхклеток, достижением ими своих клеток мишеней, формированием и поддержаниемсинаптических контактов. Все названные процессы, в свою очередь, зависят от регулируемойтрансляции особых долгоживущих мРНК, находящихся в составе комплексов РНП в состояниивременно недоступном для трансляции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
