Диссертация (1145638), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Предполагают, что такие димеры образуетполноразмерный белок NXF1 человека, взаимодействуя с коротким белком sNXF1 (от «short»),соответствующим интрон-содержащему транскрипту гена nxf1 (Li et al., 2016). Учитываяэволюционную консервативность белков NXF1, можно предположить способность колигомеризации и для белков SBR (Dm NXF1), содержащих N-терминальную часть.Исследования в нашей группе показали, что содержание транскрипта гена sbr (Dm nxf1),сохраняющего интрон, в тканях головы взрослых дрозофил превышает содержание нормальносплайсированного транскрипта (Ivankova et al., 2010). Это позволило называть интронсодержащий транскрипт гена sbr (Dm nxf1) нейроспецифичным. Позднее было показано, чтосуществование интрон-содержащего транскрипта является эволюционно-консервативной1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd125особенностью генов nxf1 у разных животных (Мамон и др., 2013; Mamon et al., 2013; Wang etal., 2015).
Более того, оказалось, что у мыши короткий белок sNXF1, соответствующий интронсодержащему транскрипту, широко представлен в гиппокампе и неокортексе мозга (Li et al.,2016), в то время как синтез полноразмерного белка в нейронах гиппокампа находится нанизком уровне (Zhang et al., 2007). Примечательно, что транскрипт гена nxf1 с сохранённыминтроном 10, кодирующий белок sNXF1, обнаружили в гиппокампе у крыс (Cho et al., 2015).Эти результаты подтверждают существование специализированной функции гена nxf1 внейрогенезе.4.3 Различия в проявлении мутантного аллеля sbr12 у самок и самцов D.melanogasterНосительство аллеля sbr12 проявляется сильнее у самцов, нежели у самок, что поднимаетвопрос о причинах, определяющих такие фенотипические различия.
Одним из предположенийявляется неравноценная компенсация аллеля sbr12 аллелем sbr+, имеющим различнуюлокализацию у самок и самцов: у самок аллель sbr+ находится в X-хромосоме, в привычной длянего локализации, а у самцов – в составе дупликации участка X-хромосомы в Y-хромосомe – внепривычной локализации. Как следствие, уровень экспрессии аллелей sbr+ в зависимости отего локализации (на X- или на Y-хромосоме) тоже может быть разным, что будет оказыватьвлияние на фенотипическое проявление аллеля sbr12. С другой стороны, различия вфенотипическом проявлении аллеля sbr12 могут быть связаны с реализацией механизма дозовойкомпенсации: у самцов D.
melanogaster происходит увеличение уровня транскрипции генов,локализованных в Х-хромосоме, за счет действия комплекса дозовой компенсации -такназываемого MSL-комплекса. Установлено, что данный комплекс состоит из 6 белков (MSL1,MSL2, MSL3, MOF, MLE и JIL1) и двух некодирующих РНК: roX1 и roX2 (RNA on the X).Одним из важнейших белков, необходимых для функционирования MSL-комплекса, являетсяMSL2 (male-specific lethal 2) (Дементьева, 2012; Ferrari et al., 2014). У самок синтез этого белкаподавляется, а в его отсутствие остальные участники не могут образовывать комплекс дозовойкомпенсации. Как следствие, у самцов ожидается более высокое содержание мутантной формыбелка – SBR12, относительно содержания белка дикого типа – SBR. При прочих равныхусловиях, у гетерозиготных самок sbr12/sbr+ соотношение этих двух форм белка SBR ожидаетсясоответствующим уровню экспрессии каждого аллеля: 1 (sbr12) : 1 (sbr+), где единица означаетобычный уровень экспрессии гена sbr, локализованного в X-хромосоме самок.
Соответственно,чем выше относительное содержание мутантной формы белка в клетке, тем существеннее будутфенотипические проявления носительства соответствующей мутации. У самцов sbr12/Dp(1;Y) засчетреализациимеханизмадозовойкомпенсацииэтосоотношениебудетиным:1262 (sbr12) : ? (sbr+), где знаком вопроса обозначен уровень экспрессии аллеля sbr+ в Y-хромосоме,а двойкой – увеличенный уровень экспрессии аллеля sbr+, локализованного в X-хромосомесамцов. При этом, продукта мутантного аллеля sbr12 у самцов sbr12/Dp(1;Y) в количественномотношении ожидается в 2 раза больше по сравнению с этим показателем у самок sbr12/sbr+. Впользу такого предположения свидетельствуют результаты Вестерн-блот анализа (Рис.
59,Ginanova et al., 2016), согласно которым у самцов sbr12/Dp(1;Y) количество белка SBR12визуально превышает количество белка SBR+. Для проверки этого предположения необходимыдополнительные исследования по определению относительного содержания обеих форм белка(SBR+ и SBR12) в тканях мозга у самцов и самок.Рисунок 59.
Результаты Вестерн-блот анализа белков, изолированных из мух различныхгенотипов. Стрелка указывает на универсальную каноническую форму белка SBR, головкастрелки – на укороченную семенниково-специфичную форму белка SBR-t. Двойная полоска, накоторую указывает головка стрелки, является доказательством присутствия аллеля sbr12 вгетерозиготе; из двух полосок - нижняя соответствует белку SBR12 с делецией 10 а.к. (дорожка4). Полноразмерный белок SBR на дорожке 4 тоже представлен в двух формах (SBR и SBR12),но из-за большой молкулярной массы, эти 2 полоски визуально неразличимы.
Источникполучения проб: 1 – яичники самок Oregon-R; 2 – головы самцов sbr12/Dp(1;Y); 3 – головысамцов FM6/Dp(1;Y) (делеция sbr12 отсутствует); 4 – семенники самцов sbr12/Dp(1;Y); 5 –семенники самцов FM6/Dp(1;Y) (делеция sbr12 отсутствует). М, kDa – маркер молекулярноговеса, кДа. (Ginanova et al., 2016)Существует еще одна нерешенная проблема, касающаяся механизма влияния мутантногоаллеля на процессы морфогенеза при формировании структур мозга у D.melanogaster.Аллель sbr12 предстaвляет собой делецию 30-ти нуклеотидoв в экзоне 9, поэтому егофенотипическое проявление будет обусловлено нарушением функции именно полноразмерногобелка (Рис. 53, Mamon et al., 2017), в котором изменена структура домена NTF2L (Ginaniova etal., 2016). Анализ взаимодействия белка NXF1 с РНК-мишенями показал особую роль этогодомена при взаимодействии с РНК, содержащими последовательность СТЕ - constitutivetransportelement,умлекопитающих(Aibaraetal.,2015;Katahiraetal.,2015).Последовательность СТЕ присутствует в РНК ретровирусов (Hammarskjӧld, 2001) и в интроне,127который сохраняется в транскриптах генов nxf1 у позвоночных.
Мы показали, что сохранениеодного и того же интрона (у млекопитающих – это интрон 10, а у дрозофилы – интрон 5) втранскриптах гена nxf1 у разных организмов является эволюционно-консервативнойособенностью генов nxf1 (Мамон и др., 2013; Mamon et al., 2013; 2014). Присутствие СТЕ всохраненном интроне транскриптов генов nxf1 характерно для позвоночных (Мамон и др., 2013;Mamon et al., 2013; 2014; Wang et аl., 2015), но не для дрозофилы. Учитывая эволюционнуюконсервативностьгомологичныйсамогоинтрон,последовательности,мыгенаnxf1ипредположили,формирующиесуществованиячтосложнуювтранскриптов,интроневторичную5генаструктуру,сохраняющихDmвnxf1том(sbr)числе,консервативные протяженные последовательности поли(А), являются функциональнымианалогами СТЕ в интроне 10 гена nxf1 позвоночных (Мамон и др., 2013).
Если это так, то доменNTF2L в белке SBR важен и для биогенеза интрон-содержащего транскрипта гена Dm nxf1 (sbr),как это показано для позвоночных (Aibara et al., 2015; Katahira et al., 2015). Поскольку именноинтрон-содержащий транскрипт гена Dm nxf1 (sbr) является мажорным в тканях головывзрослых дрозофил, он был назван нейроспецифичным (Ivankova et al., 2010). По аналогии спозвоночными, этот интрон-содержащий транскрипт гена Dm nxf1 (sbr) может быть партнеромбелка Dm NXF1 (SBR) в цитоплазме, то есть, появление короткого белка, соответствующегоинтрон–содержащему транскрипту гена sbr, может зависеть от полноразмерного белка DmNXF1 (SBR). Присутствие интрона в транскрипте может служить маркером, определяющимлокализацию и регуляцию трансляции этого транскрипта в цитоплазме и, соответственно,регулировать появление короткого белка sNXF1 (SBR-ir).
Все это определяет дальнейшиеперспективы исследования роли гена гена sbr (Dm nxf1) и соответствующего ему транскрипта синтроном, а также функции короткого белка SBR-ir в нейрогенезе, начатые в настоящей работе.Полученные результаты поднимают вопросы, на которые предстоит ответить вдальнейшем:1.В состав каких комплексов входит SBR (Dm NXF1)2.Каковы специфичные мРНК-мишени белка SBR (Dm NXF1) и есть ли среди нихтранскрипт гена sbr (Dm nxf1), содержащий интрон.3.Каковы функции короткого белка sNXF1 (SBR-ir) в нейрогенезе.128ЗАКЛЮЧЕНИЕРезультаты, полученные в ходе выполнения данного исследования, указывают на то, чтобелок SBR у D.
melanogaster выполняет альтернативные цитоплазматические функции, важныедля формирования и функционирования нервной системы, помимо обеспечения экспорта мРНКиз ядра в цитоплазму. Белок SBR выявляется в виде гранул в цитоплазме клеток и формируетзоны преимущественной локализации в мозге развивающейся личинки дрозофилы, маркируяопределенные нейробласты и их потомков. Присутствие белка SBR в составе РНП-гранул вотростках нейронов позволяет предполагать, что альтернативная цитоплазматическая функцияэтого белка связана с сопровождением определенных мРНК в процессе цитоплазматическоготранспорта.Нарушение функции полноразмерного белка SBR, вызванное делецией sbr12, удаляющей10 аминокислот из домена NTF2L и области полилинкера между доменами NTF2L и UBA,приводит к тяжелым дефектам структуры и функции мозга у самцов, несущих аллель sbr12 вгетерозиготе.
У таких самцов снижение активности в тесте на отрицательный геотаксиссопровождается аномалиями формирования эллипсоидного тела и медуллы мозга, а такженейродегенеративными повреждениями, затрагивающими, в основном, зрительные доли мозгаи ретину. Характер нарушений формы эллипсоидного тела и медуллы, а также выявленныхдефектов структуры коннектома, формируемого аксонами фоторецепторных нейронов вмедулле у таких самцов sbr12/Dp(1;Y), указывают на нарушение процессов роста и нацеливанияаксонов нейронов. Присутствие аллеля sbr12 у самок не оказывает существенного влияния наструктуру мозга, но с возрастом приводит к снижению активности в тесте на отрицательныйгеотаксис. Изменение дозы гена sbr, а также хромосомной локализации аллеля sbr+, неоказывает существенного влияния на структуру мозга самцов и самок.
В то же время,изменение хромосомной локализации аллеля sbr+ (из X-хромосомы - в Y-хромосому) у самцовL4/Dp(1;Y) приводит к снижению активности, проявляемой в тесте на отрицательный геотаксис.Эти данные свидетельствуют о том, что уменьшение дозы гена sbr (Dm nxf1) является болеекритичным событием для особей, чем увеличение его дозы, а присутствие аллеля sbr+ в Yхромосоме имеет ограниченный компенсаторный эффект. Различия в фенотипическомпроявлении аллелей sbr12 и L4 у самцов и самок могут быть обусловлены включениеммеханизма дозовой компенсации у самцов, а также ограниченным компенсаторным эффектомаллеля sbr+, локализованного в Y-хромосоме. Доминантный характер фенотипическогопроявления свидетельствует о том, что белок SBR может функционировать в составемакромолекулярных комплексов, и одним из его партнёров может служить нейроспецифичныйкороткий белок SBR-ir: в этом случае, нарушение функции полноразмерного белка SBR будет129приводить к потере функциональности такого комплекса в целом; а также о том, что средипартнеров белка SBR в цитоплазме нервных клеток может присутствовать интрон-содержащийтранскрипт гена sbr, тогда у носителей мутации sbr12 могут нарушаться временные,пространственные и количественные праметры синтеза короткого белка SBR-ir.Полученные результаты поднимают вопрос о молекулярном механизме реализацииспециализированной цитоплазматической функции белка SBR в нервной системе и открываютширокие перспективы для дальнейших исследований.130ВЫВОДЫ1.Белок SBR выполняет специализированные цитоплазматические функции, важные дляформирования и функционирования нервной системы Drosophila melanogaster,присутствуя в виде гранул в отростках нервных клеток.2.У самцов-имаго рецессивный летальный аллель sbr12, нарушающий их половоеповедение,в гетерозиготномсостоянииимеетдоминантныефенотипическиепроявления: вызывает появление дефектов структуры отдельных нервных центровмозга и снижает активность особей в тесте на отрицательный геотаксис.3.У самок-носительниц аллеля sbr12 нет врожденных структурных нарушений мозга, аснижение их активности в тесте на отрицательный геотаксис проявляется с возрастом.4.Присутствие единственного аллеля sbr+ у самцов только в Y-хромосоме не вызываетдефектов формирования нервных центров и приводит к снижению активности в тестена отрицательный геотаксис в меньшей степени, чем у самцов, гетерозиготных поаллелю sbr12.5.У гетерозиготных самок делеция гена sbr приводит к снижению показателей ихактивности в тесте на отрицательный геотаксис в возрасте, превышающем 15 суток, и вменьшей степени, чем присутствие аллеля sbr12, не вызывая дефектов формированияструктуры нервных центров в мозге.6.Структурные аномалии медуллы, выявляемые у взрослых самцов, гетерозиготных поаллелю sbr12, вызваны нарушением роста и терминации аксонов фоторецепторныхнейронов, а также нейродегенерацией, детектируемой уже на личиночной стадииразвития.131СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.Аванесян Э.О.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
