Диссертация (1145638), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Особый тип долгоживущих локализованных мРНК позволяет с участиемсигнальных систем очень быстро обеспечивать синтез необходимого белка в нужном месте.4.2.1 Роль цитоскелета и локализованной трансляции мРНК в формированиинервной системыЛокализованныемРНКиассоциированныес нимиРНК-связывающиебелки,предотвращающие их преждевременную трансляцию и деградацию, играют важную роль вразвитии и функционировании нервной системы (Lin and Holt, 2008; Medoni et al., 2012; Mamonet al., 2017).
Одним из таких примеров служит белок FMRP – компонент транспортных РНПгранул, сопровождающий определенные мРНК к месту их локализации в нейронах. Нарушениефункции этого белка приводит к целому комплексу эффектов, затрагивающих структуру ифункцию нервной системы: от формирования дендритных шипиков аномальной формы, доформирования аномальных нейронных сетей из-за неправильного нацеливания аксоновнейронов (Bassell and Warren, 2008; Tessier and Broady, 2008; Bhakar et al., 2012; Hagerman et al.,2017).
Оба этих эффекта могут быть следствиями нарушения цитоскелета в районесинаптических контактов.Цитоскелет играет принципиальное значение для формирования корректных нейронныхсетей: на активной реорганизации цитоскелета основаны такие процессы, как поворот конусароста аксона в зависимости от поступающих сигналов, рост аксонов, формирование шипиков.
Впользу утверждения о важности цитоскелета для формирования мозга свидетельствуетмножество примеров мутаций в генах, кодирующих белки, ассоциированные с цитоскелетом.Например, мутации генов Cib (Ciboulot) (Boquet et al., 2000a,b) и ebo (ellipsoid body open) (Iliuset al., 1994, 2007; Thran et al., 2013) нарушают, в основном, структуру именно ЭТ. Известны121гены, нарушение функции которых приводит к дефектам архитектуры коннектома, в основном,в медулле (Ohler et al., 2011). В основе таких структурных дефектов функциональных центровмозга, как правило, лежит некорректное нацеливание аксонов нейронов (Boquet et al., 2000a;Thran et al., 2013).
В последнее время появляется всё больше данных о роли локализованныхмРНК в динамике цитоскелета: многие мРНК, кодирующие белки, ассоциированные сцитоскелетом, концентрируются в местах его активной реорганизации (Huang et al., 2007; Miliet al., 2008; Medoni et аl., 2012; Klein et al., 2013). Таким образом, нарушение функции РНКсвязывающих белков, обеспечивающих адресную доставку таких мРНК к месту ихлокализации, могут иметь сходный эффект с мутациями в генах, транскриптами которыхявляются эти мРНК.Среди РНК-связывающих белков в составе комплексов РНП может присутствовать ибелок SBR.
Об этом свидетельствуют полученные нами данные: белок SBR выявляется в видегранул в отростках нейронов, причем, как совместно с белком dFMR1, являющимся маркёромРНП-гранул, так и отдельно от него. Такой характер локализации белка SBR указывает навыполнение им цитоплазматических функций, по-видимому, связанных с сопровождениемопределенных мРНК к месту дислокации.
По крайней мере, часть гранул, содержащих белокSBR, является транспортными РНП-гранулами – об этом говорит присутствие в них белкаdFMR1. Гранулы, в которых белок SBR выявляется без белка dFMR1, по-видимому, тожеявляются транспортными РНП-гранулами, но в их состав не входят мРНК, для транспортакоторых необходим белок dFMR1. Полученные нами результаты (Yakimova et al., 2016)согласуются с данными литературы о цитоплазматических функциях белков NXF2 и NXF7мыши, а также NXF5 человека.
Эти белки важны для формирования и функционированиянервной системы, а их функции связаны с обеспечением цитоплазматического транспортаопределенных мРНК в нейронах (Tan et al., 2005; Lai et аl., 2006; Tretyakova et al., 2005; Takanoet al., 2007; Zhang et al., 2007; Kаtahira et al., 2008; Grillo et al., 2010; Vanmarsenille et al., 2013;Callaerts-Vegh et al., 2015). Примечательно, что белок NXF2 непосредственно взаимодействуетс белком FMRP, контролируя стабильность транскрипта nxf1 в нейронах мыши (Zhang et al.,2007).Кроме того, для белка NXF2 показано взаимодействие с моторными белкамицитоплазмы, например, с кинезиноподобным белком Kif17, а также с белками MAP1A иМАР1B и рядом других белков, участвующих в цитоплазматическом транспорте РНП-гранул(Tretyakova et al., 2005; Takano et al., 2007; Katahira et al., 2008).Следует отметить, что, участвуя в ядерном экспорте, белок SBR (NXF1) не обнаружваетспецифичности в отношении различных типов мРНК, тогда как состав комплексов, содержащихSBR в цитоплазме, входят некие специфические мРНК-мишени, присутствующие не во всехРНП-гранулах.
В противном случае, белок SBR маркировал бы все РНП, и мы не выявили бы122РНП-гранулы, содержащие белок dFMR1 без белка SBR. Дальнейшие исследования будутнаправлены на поиск этих специфических мРНК-мишеней.4.2.2 Влияние дозы гена sbr на поведение и структуру мозга самок и самцовD. melanogsterСледует обратить внимание на то, что, в отличие от млекопитающих, у которыхортологичный ген nxf1 располагается в аутосоме, у D. melanogaster ген sbr (Dm nxf1)локализуется на Х-хромосоме. Поскольку большинство мутантных аллелей гена sbr являютсялетальными, жизнеспособных самцов, носителей рецессивных летальныхаллелей, можнополучить только с использованием Y-хромосомы с аллелем sbr+, находящимся в составедупликации Dp(1;Y )y+ v+. Таким образом, самки и самцы, гетерозиготные по нулевому аллелюгена sbr, являются жизнеспособными благодаря присутствию аллеля sbr+: в Х-хромосоме – усамок, и в Y-хромосоме – у самцов.
Сравнительный анализ таких особей между собой и ссоответствующими контролями позволяет ответить на вопрос, влияет ли на активность самок втесте на ОГТ уменьшение дозы гена и насколько присутствие аллеля sbr+ в Y-хромосомекомпенсирует отсутствие этого гена в Х-хромосоме у самцов.Действительно, согласно полученным результатам, наличие единственной копии генаsbr (Dm nxf1) в составе дупликации участка Х-хромосомы в Y-хромосоме на фоне делеции L4,удаляющей ген sbr в Х-хромосоме, обеспечивает необходимый для нормального формирования,но недостаточный для полноценного функционирования нервной системы уровень экспрессииэтого гена: об этом свидетельствует отсутствие видимых нарушений структуры мозга у самцовL4/Dp(1;Y), наряду со снижением у них активности в тесте на ОГТ относительно таковой мухдикого типа.
При этом, наличие такой дупликации на фоне аллеля sbr+, локализованного в Ххромосоме в естественном микроокружении, не приводит ни к дефектам формированиянервной системы, ни к дефектам ее функционирования: по всем тестируемым параметрамсамцы sbr+/Dp(1;Y) не отличаются от самцов дикого типа. Одинаковый уровень транскрипцииобеих Х-хромосом у самок L4/sbr+ из-за наличия делеции L4 на одной из них, по видимому,приводит к тому, что уровень экспрессии гена sbr (Dm nxf1), у них, как и у самцов L4/Dp(1;Y),является достаточным для нормального формирования, но недостаточным для полноценногофункционирования нервной системы: уже в возрасте 15-17 суток активность самок L4/sbr+ втесте на ОГТ статистически значимо снижена относительно таковой у самок дикого типа.
Болеевыраженное проявление снижения активности в тесте на ОГТ у самцов L4/Dp(1;Y), посравнению с самками L4/sbr+, может указывать на то, что уровень экспрессии аллеля sbr+,локализованного у самцов в Y-хромосоме, является более низким, чем уровень экспрессии123единственного аллеля sbr+, локализованного в одной из Х-хромосом у самок L4/sbr+. Этиданные свидетельствуют о том, что уменьшение дозы гена sbr (Dm nxf1) является болеекритичным событием для особей, чем увеличение его дозы, а присутствие аллеля sbr+ в Yхромосоме имеет ограниченный компенсаторный эффект.4.2.3 Доминантно-негативные эффекты аллеля sbr12К доминантно-негативному проявлению мутантного белка могут приводить различныепричины.
Среди них наиболее частыми можно назвать следующие:1.Мутантный белок может накапливаться, формируя белковые агрегаты, что частоявляется причиной гибели нервных клеток.2.Нарушение временных и/или пространственных параметров функции мутантного белка,если его функция в клетке подчинена строгой регуляции. Для РНК-связывающих белков,входящих в состав комплексов РНП и сопровождающих долгоживущие мРНК,изменения в белке могут приводить к неустойчивости комплекса РНП и незаконномувыходумРНКизсоставакомплексаРНП.Несвоевременнаятрансляциявысвобожденных мРНК-мишеней и/или их трансляция не в месте назначения такжемогут иметь негативные последствия.3.Мутантный белок может функционировать в виде мультимера.
В этом случае мутация вгетерозиготе будет иметь фенотипическое проявление, поскольку включение в составмультимера хотя бы одной единицы мутантного белка будет приводить к потерефункциональности всего комплекса в целом, и количество функциональных комплексовв клетке будет значительно снижено.Каждый из этих механизмов способен объяснить доминантно-негативные эффектымутантного аллеля sbr12.Мутация sbr12 – это делеция 30 нуклеотидов (н.) в районе экзона 9 гена sbr. В белкеSBR12 отсутствует 10 аминокислот (а.к.) – TIFINATHE, из которых шесть первых а.к.принадлежат домену NTF2L, а остальные четыре – находятся вне этого домена (Рис. 58)(Mamon et al., 2017).
Делеция изменяет структуру домена NTF2L (Гинанова, 2017),отвечающего за взаимодействие с белком NXT1 (p15), который является постояннымпартнером NXF1 (Bachi et al., 2000; Fribourg et al., 2001). Кроме того, домен NTF2L, как и доменUBA, обеспечивает взаимодействие белка NXF1 с нуклеопоринами – белками ядерных поровыхкомплексов, и, соответственно, транспорт всей мРНП-частицы из ядра в цитоплазму (Fribourg et124al., 2001; Braun et al., 2002). Примечательно, что мутация sbr12 затрагивает толькополноразмерный белок, в то время как короткий белок (продукт трансляции альтернативноготранскрипта с сохранённым интроном 5-6) не изменяется (Рис. 58).Рисунок 58. Доменная организация белка SBR (в соответствии с Conserved Domain Database1(CDD), NCBI).
Условные обозначения: RBD — РНК-связывающий домен; LRR — домен,богатый лейциновыми повторами; NTF2L — домен, похожий на белок NTF2 (nuclear transportfactor 2); UBA — домен, ассоциированный субиквитином. NLS – сигнал ядерной локализации.Белок SBR-ir представляет собой продукт трансляции альтернативного транскрипта ссохраненным интроном 5 (на основе Mamon et al., 2017, с изменениями)Структура N-терминальных доменов белка SBR (Dm NXF1), отвечающих завзаимодействие с мРНК и белками-партнерами NXF1, в мутантном белке SBR12 не изменена. ВN-терминальной части белка SBR (Dm NXF1) у дрозофилы, как и у млекопитающих, находитсясигнал ядернoй локализации (Zhang et al., 2011). Таким образом, белок SBR12 должен сохранятьвозможность перемещаться в ядро. Интересно, что в N-терминальной части белка NXF1человекаприсутствуетещеипоследовательностьолигомеризации,обеспечивающаявзаимодействие белков NXF1 между собой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
