Диссертация (1145638), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Благодаря взаимодействию РНК и белков формируютсярибонуклеопротеиновые (РНП) комплексы, присутствующие в цитоплазме в виде гранул,называемых: Р-гранулами (processing bodies), S-гранулами (stress granules), нейронными РНКгранулами (Anderson and Kedersha, 2006; Kiebler and Bassell, 2006; Gumy et al., 2013).
РНПгранулысодержатэлементырибосом,факторыинициациитрансляции,различныетранспортные и сигнальные белки (Barbee et al., 2006; Giorgi et al., 2007; Martin and Ephrussi,2009), микроРНК (Liu et al., 2005; Jаkymiw et al., 2007; Müller-McNicoll and Neugebauer, 2013), атакже факторы, вызывающие деградацию РНК (Luchelli et al., 2015). Перемещение РНПкомплексов по элементам цитоскелета (МТ и АФ) обеспечивают моторные белки (Tekotte andDavis, 2002; Gumy et al., 2013). Доставка РНП-комплекса в определенное место клеткипозволяет синтезировать белки именно в том месте, где требуется их функциональнаяактивность (Van Horck and Holt, 2008).Многообразие состава РНП-гранул затрудняет изучение их структуры и функций (Kanaiet al., 2004; Kiebler and Bаssell, 2006; Gumy et al., 2013).
Состав белков и некодирующих РНК,которыепопадутвконкретнуюРНП-гранулу,вомногомзависитотсигнальныхпоследовательностей в мРНК, определяющих её судьбу в цитоплазме (Patel et al., 2012; Gardineret al., 2015). При этом, локализацию одной и той же мРНК могут определять разные знаковыепоследовательности (цис-действующие элементы), и соответственно, разные РНК-связывающиебелки (транс-активирующие факторы) могут взаимодействовать с одними и теми же мРНК. Вто же время, различные мРНК могут иметь одинаковые цис-действующие элементы ивзаимодействовать с одними и теми же факторами (Keene and Lager, 2005; Van Horck and Holt,2008).66В цитоплазме часть белков покидает вышедший из ядра РНП-комплекс (Cole andScarcelli, 2006; Björk and Wieslander, 2011).
Состав белков, которые останутся сопровождатьмРНК в цитоплазме, чаще всего определяется информацонными последовательностями,которые находятся в ее 3'- и/или 5'-UTR (Andreassi and Riccio, 2009). Наиболее известной изтаких является последовательность ARE (Adenylate-Uridylate Rich Element), обогащеннаяаденином (А) и уридином (U). Как правило, ARE располагаются в 3'-UTR (Shaw and Kamen,1986). Эту последовательность узнают и белки, стабилизирующие мРНК, и белки,способствующие ее деградации (Bolognani and Perrone-Bizzozero, 2008; Gardiner et al., 2015). Вэтом двунаправленном процессе задействованы и микроРНК (Jacobsen et al., 2010; Gardiner etal., 2015). AU- или U-обогащенные последовательности присутствуют в 3'-UTR многих мРНК,вовлеченных в клеточный рост и дифференцировку, т.е.
как раз тех процессов, которыенапрямую зависят от цитоскелета. Последовательности ARE связывают белки семейства Hu(Bolognani et al., 2010). Один из белков этого семейства – HuD – отвечает за стабилизациюопределённых мРНК в нейронах (Deschênes-Furry et al., 2006). Белок HuD взаимодействует и срядом РНК-связывающих белков, включая Hs NXF1 (TAP) (Saito et al., 2004). Примечательно,что в составе РНП-гранул, сохраняющих в цитоплазме в защищённом от трансляции состоянииособые долгоживущие мРНК, обнаруживают белки семейства NXF, например: MmNXF2,MmNXF7,HsNXF5,т.е.специализированныепаралогибелкаNXF1,выполняющиецитоплазматические функции.
У D. melanogaster нейроспецифичные паралоги не известны, носпециализированные функции в нервной системе могут выполнять альтернативные продуктыгена sbr (Dm nxf1).Существование мутаций в гене sbr (Dm nxf1) у D. melanogaster, затрагивающихструктуру и функцию нервной системы, а также сложный характер экспрессии этого гена,предполагающий синтез альтернативных ткане- и органоспецифичных (в том числе,нейроспецифичных) белков, предполагает наличие альтернативных функций продуктов генаsbr. Природа этих функций остаётся неясной, но, вероятно, они связаны с сопровождениемопределенных долгоживущих мРНК в цитоплазме клеток.
Поскольку долгоживущие мРНКиграют значительную роль в регуляции развития и функционирования нервной системы,детальное изучение причин нарушения поведения у D. melanogaster, несущих мутации в генеsbr, может пролить свет на механизм возникновения этих аномалий.672 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1 Линии и гибриды D. melanogaster, условия их культивированияВработубыливзятыплодовыемушкиDrosophilamelanogaster.Генотипы,характеристика и источник получения линий представлены в Табл. 2.Таблица 2. Взятые в работу линии Drosophila melanogaster и их описание.Название линииХарактеристикаИсточник полученияКоллекция кафедрыЛиния дикого типаOregon Rгенетики СПбГУСодержит летальный аллель гена sbr - Получена отl(1)24/45A(sbr12),индуцированный И.Ф.
Жимулевафактором рекомбинации у самцов MRh12; (коллекция Институтаl(1)24/45A / FM6, ysc8 dm Bподдерживается на балансере FM6. В цитологии и генетикибалансере FM6 находится аллель гена sbr СО АН, Новосибирск)дикого типа, а также маркеры: yellow,scute8, diminutive, Bar. Плодовитые самкиимеют генотип sbr12/FM6; самки FM6/FM6– стерильны; самцы - FM6/Y.Содержитмутации:raspberry2– Получена оторанжевые глаза, Df(1)vL4 – делеция всего И.Ф.
Жимулевагенаras2 Df(1)vL4 mD /FM6l, y sc8 dm B /+ +Dp(1; Y) v ysbr(L4),miniature-Dominant– (коллекция Институтазачаточные крылья. Поддерживается на цитологии и генетикибалансере FM6l, содержащим леталь, и СО АН, Новосибирск)Dp(1:Y) v+ y+ - дупликации участка Ххромосомы, содержащего аллели дикоготипа генов: sbr, vermilion, yellow. Самкиимеют генотип ras2 Df(1)vL4 mD / FM6,самцы - ras Df(1)vL4 mD / Dp(1; Y) v+ y+.Примечание. Описание генотипа линий дано в соответствии со справочником Lindsely and Grell, 1968.D.
melanogaster культивировали на изюмной питательной среде при температуре22-24 °С.68Выбор генотипов самцов и самок D. melanogaster, взятых в работу, обусловленнеобходимостью использования дополнительных контролей. Поскольку ген sbr локализован вХ-хромосоме, а аллель sbr12 является рецессивной леталью, самцы, несущие этот аллель,поддерживаются на специально сконструированной Y-хромосоме, содержащий фрагмент Ххромосомы с аллелем sbr+ - дупликацию Dp(1;Y)y+ v+. В результате, в фенотип таких самцов,наряду с присутствием мутантного аллеля sbr12, могут вносить вклад: изменение дозы гена sbr(одна доза у самцов дикого типа против двух доз у самцов sbr12/Dp(1;Y) v+y+) и изменениехромосомной локализации аллеля sbr+ (в Х-хромосоме у самцов дикого типа, противлокализации в Y-хромосоме – у самцов sbr12/Dp(1;Y) v+y+). Аналогично у самок: в фенотипгетерозиготных самок sbr12/sbr+, помимо аллеля sbr12, может вносить вклад уменьшение дозыаллеля sbr+ (два аллеля sbr+ у самок дикого типа против одного аллеля sbr+ у гетерозиготныхсамок sbr12/sbr+).
Для того, чтобы дифференцировать эффекты присутствия аллеля sbr12,изменения дозы гена sbr и изменения хромосомной локализации аллеля sbr+, в работу быливзяты самцы (4 генотипа) и самки (3 генотипа) D. melanogaster, отличающиеся по этимпараметрам:1.Самцы sbr+/Y (дикий тип, линия Oregon-R) - 1 аллель sbr+ в Х-хромосоме;2.Самцы ras2 Df(1)vL4 mD /Dp(1;Y)y+ v+ – несут только 1 аллель sbr+ в составе дупликацииучастка Х-хромосомы, перенесенного в Y-хромосому (взяты из линии ras2 Df(1)vL4 mD /FM6l, y sc8 dm B / Dp(1; Y) v+y+);3.Самцы +/Dp(1;Y) v+y+ – имеют 2 дозы гена sbr: 1 аллель sbr+ в Х-хромосоме и 1 аллельsbr+ в составе дупликации участка Х-хромосомы, перенесенного в Y-хромосому(получены в результате скрещивания самок Oregon-R с самцами ras2 Df(1)vL4 mD/Dp(1;Y)y+ v+);4.Самцы sbr12/Dp(1;Y) v+y+ – мутантные гетерозиготные самцы, несущие рецессивныйлетальный аллель sbr12 в Х-хромосоме и аллель sbr+ в составе дупликации участка Ххромосомы, перенесенного в Y-хромосому (получены в результате скрещивания самокl(1)24/45A / FM6, y sc8 dm B с самцами ras2 Df(1)vL4 mD /Dp(1;Y)y+ v+);5.Самки sbr+/ sbr+ (дикий тип, линия Oregon-R) – два аллеля sbr+ - по одному в каждой Ххромосоме;6.Самки sbr12/ sbr+ – несут аллель sbr12 в одной Х-хромосоме и аллель sbr+ - во второй;7.Самки ras2 Df(1)vL4 mD / sbr+ – несут единственный аллель sbr+ в одной из Х-хромосом(получены в результате скрещивания самок Oregon-R с самцами ras2 Df(1)vL4 mD/Dp(1;Y)y+ v+).69Рецессивный летальный аллель sbr12 поддерживают в линии мух с использованиембалансера FM6, y sc8 dm B.
При поддержании линии в культуре имеются: плодовитые самкиsbr12/ FM6, y sc8 dm B, стерильные самки FM6, y sc8 dm B / FM6, y sc8 dm B, а также плодовитыесамцы FM6, y sc8 dm B/Y. Несут мутацию sbr12 только самки sbr12/ FM6, y sc8 dm B. Дляполучения жизнеспособных самцов с мутацией sbr12 необходимо провести дополнительныескрещивания.
Для скрещивания отбирали по фенотипу девственных самок линии l(1)24/45A /FM6, y sc8 dm B (они отличаются от самок FM6, y sc8 dm B / FM6, y sc8 dm B тем, что имеютсерую окраску тела и глаза полу-Bar) и самцов ras2 Df(1)vL4 mD /Dp(1;Y)y+ v+ из линии ras2Df(1)vL4 mD / FM6l, y sc8 dm B /Dp(1; Y) v+y+. Схема скрещивания приведена на Рис. 28.Самцов, имеющих 2 дозы гена Dm nxf1, а также самок, имеющих одну дозу гена sbr,получали путем скрещиваний по схеме, приведенной на Рис.
29 (самцы выделены в кружок).Для скрещивания отбирали девственных самок Oregon-R и самцов ras2 Df(1)vL4 mD /Dp(1;Y)y+v+ из линии ras2 Df(1)vL4 mD / FM6l, y sc8 dm B /Dp(1; Y) v+y+.Р:F1:sbr12ras2 Df(1)vL4 mDFM6 y BDp (1:Y) v+y+sbr12ras2 Df(1)vL4 mDsbr12Dp (1:Y) v+y+FM6 y Bras2 Df(1)vL4 mDFM6 y BDp (1:Y) v+y+(леталь)Самцы, включенные в экспериментФенотип самцов:дикий типBarРисунок 28. Схема скрещивания для получения самцов, несущих аллель sbr12 в гетерозиготе.70Р:+ras2 Df(1)vL4 mD+Dp (1:Y) v+y+Все самцы имеют 2 дозы гена sbr:F1:++в Х-хромосоме и в составедупликации Dp (1:Y) v+y+ras2 Df(1)vL4 mDDp (1:Y) v+y+в Y-хромосомеCамки, 1 доза гена sbrРисунок 29.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
