Диссертация (1140411), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Далее осуществляли качественную оценку результатов ИГХ-реакций(наличие/отсутствие положительного окрашивания матрикса). Фотографированиепрепаратовпроизводилиспомощьюописанныхвышемикроскопасвидеокамерой и программным обеспечением.2.2.3 Нелинейная оптическая микроскопияНЛОМ-исследование было выполнено на базе ФГАОУ ВО «МФТИ(государственный университет)» на депарафинированных, заключенных всинтетическую среду, неокрашенных срезах толщиной 10-20 мкм с помощьюсистемы лазерной сканирующей микроскопии LSM 510 META (Carl Zeiss,Германия).
Нелинейное возбуждение осуществлялось импульсным (100 фс)излучением Ti:сапфир лазера (MaiTai HP, Spectra Physics, США) на длине волны800 нм с частотой повторения импульсов 80 MГц и средней мощностью 10 мВт.Обратно направленный сигнал генерации второй гармоники (ГВГ) выделяли спомощью дихроичного фильтра видимого излучения (KP650, Carl Zeiss) иузкополосного фильтра (400 / 10 нм). Изображение среза, содержащее 1024 × 1024пикселя, формировалось с помощью объективов типа Plan-Neofluar (Carl Zeiss) сувеличением × 630 с иммерсией в масле. Изображение при этих увеличенияхсоответствовалообластисфизическимиразмерами225×225мкм,47соответственно.
Каждая линия изображения усреднялась по 8 сканам дляулучшения отношения сигнал-шум. Изображение обрабатывали с помощьюоригинальногопрограммногообеспеченияCarlZeissLSM510META.Изображение, получаемое с использованием фотоумножителя, отображалораспределение интенсивности сигнала ГВГ, который кодировали оттенкамизеленого цвета различной степени яркости: наиболее интенсивный сигналобозначали ярко-светло-зеленым цветом, ослабленный – темно-зеленым цветом,вплотьдотемно-серо-зеленого.Второйтипсигнала(двухфотоннаяфлуоресценция – ДФФ) выявлял структуры, содержащие флуорофоры, такие какклеточные белки и некоторые компоненты ЭЦМ хряща. Его кодировали краснымцветом разной степени интенсивности (наиболее яркое свечение соответствовалонаиболее интенсивному сигналу).
Оба сигнала регистрировали на двухспектральных детекторах одновременно: для ГВГ с фильтрами 395 – 405 нм, дляДФФ с фильтрами 490 – 600 нм. Изображения, полученные при НЛОМ содновременной регистрацией сигналов ГВГ и ДФФ изучали для оценкираспределения коллагеновых структур и их соотношения с другими элементамихрящевой ткани.2.2.4 Трансмиссионная электронная микроскопияТЭМ и СЭМ были выполнены на базе ФГБОУ ВПО «МГУ имени М.В.Ломоносова» и лаборатории соединительной ткани и клеточных технологийФГБУ «НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова» Минздрава России.
Для ТЭМ образцытканей фиксировали в 2,5 % растворе глутаральдегида, контрастировали внасыщенном водном растворе уранилацетата. Полученные на ультратоме LKB-IV(Швеция) из блоков срезы толщиной 25 нм дополнительно контрастировали внасыщенном растворе OsO4. Далее ультратонкие срезы просматривали ифотографировали в трансмиссионных электронных микроскопах TICMA-12(Голландия) и HT-7700 (Hitachi, Япония). Предварительно, перед исследованием втрансмиссионном электронном микроскопе, из полученных блоков готовилиполутонкие срезы толщиной 1 мкм, которые окрашивали трехцветным методом с48помощью метиленового синего, азура II и основного фуксина (МАFТ) и затемизучали и фотографировали с помощью описанных выше светового микроскопа,фотокамеры и программного обеспечения.2.2.4 Сканирующая электронная микроскопияДлясканирующейэлектронноймикроскопии(СЭМ)использовалинеокрашенные и не заключенные в синтетическую среду депарафинированныесрезы толщиной 20 мкм, которые после нанесения их на адгезивныеполилизиновые стекла и напыления золота изучали и фотографировали насканирующем электронном микроскопе Zeiss Supra 40VP (Carl Zeiss Group(Германия)) с ускорением электронов 10 кВ и рабочей дистанцией 4.3 мм.2.2.6 Атомно-силовая микроскопияАСМ была выполнена на базе Института регенеративной медициныФГАОУ ВО Первый МГМУ им.
И.М. Сеченова (Сеченовский университет)Минздрава России. Неокрашенные и не заключенные в синтетическую средудепарафинированные срезы толщиной 5 мкм, помещенные на адгезивныеполилизиновые стекла, изучали с использованием техники PeakForce QuantitativeNanomechanical Mapping mode (PeakForce QNM) на атомно-силовом микроскопеMultiMode 8 atomic force microscope with a Nanoscope V controller and E scanner(Bruker).Областидлясканированияотбиралипослегистологическогоисследования этих же срезов.
Из каждой интересующей области матриксаотбирались минимум 5 изображений для последующего анализа.Изображения получали с помощью зондов RTESPA-150 (Bruker) сноминальным модулем упругости 5 и 40 Н/м, номинальной частотой 150 и300 кГц и номинальным радиусом кончика 8 нм. Чувствительность кантилевера котклонениям измерялась относительно стандартам по образцу (Bruker).
Реальныемодули упругости кантилеверов измеряли с помощью метода тепловойнастройки. Радиус кончика оценивали с помощью относительного методаиспользуя стандартный полистирол (Bruker).49Каждое изображение получали при изучении площади среза 3 3 и5 5 мкм при скорости сканирования 1 Гц и при разрешении 512 512 пикселейпосредством инструментов Height, Peak Force Error (by the DTM model).Нативные АСМ-изображения были обработаны и проанализированыпрограммой NanoScope Analysis v.1.10 software (Bruker).2.2.7 Морфометрическое исследованиеВ целях объективизации полученных результатов было проведеноморфометрическое исследование фотографий 68 поперечных срезов реберныххрящей, окрашенных гематоксилином и эозином (24 – при КД, 24 – при ВД, 20 –группедетейснормальнойгруднойклеткой).Всюплощадьсрезовфотографировали при темнопольной микроскопии (объектив HC PL FLUOTAR10 × / 0,30 PH1; площадь области снимка 1245 × 934 мкм, площадь фотографии2764800 пикселей).
Каждому изображению присваивали порядковый номер сформированием серий из 20 – 50 микрофотографий на каждый микропрепарат взависимости от размера образца. Далее с помощью генератора случайных чисел[111] были отобраны по 10 микрофотографий из каждой серии. Для каждогопредварительно выделенного нами типа фокусов фибриллизации матрикса(см. главу «Результаты исследования»), а также – хрящевых каналов, в выбранныхполях зрения производили оценку частоты встречаемости в полях зрения (впроцентах) и средней относительной площади.
Среднюю относительную площадьфокусов фибриллизации рассчитывали по формуле1 [мкм2] = a1 × 10 × 0.42 мкм2 / пиксель,где(1)X – средняя относительная площадь фокусов фибриллизации в 10 поляхзрения (в мкм2);а1 – сумма площади фокусов фибриллизации в 10 полях зрения (впикселях);500.42 мкм2 / пиксель – геометрический коэффициент, используемый дляперерасчета пикселей в мкм2.Среднюю относительную площадь хрящевых каналов рассчитывали поаналогичной формуле2 [мкм2] = a2 × 10 × 0.42 мкм2 / пиксель”,где(2)X2 – средняя относительная площадь хрящевых каналов в 10 полях зрения (вмкм2);а2 – сумма площади хрящевых каналов в 10 полях зрения (в пикселях),0.42 мкм2 / пиксель–геометрическийкоэффициент,используемыйдляперерасчета пикселей в мкм2.Измерение площадифокусов фибриллизациии хрящевых каналовпроизводили вручную при помощи лицензионной программы Adobe PhotoshopCS6 (инструменты: «Brightness/Contrast», «Magnetic lasso tool»).Также в каждом из выбранных 10 полей зрения производили расчет общегоколичества лакун и количества пустых лакун (инструмент Count Tool).
Среднееколичество лакун на 10 полей зрения рассчитывали по формулеY = (y1 + y2 + … + y10) / 10,(3)где Y – среднее количество лакун в 10 полях зрения;(y1 + y2 + … + y10) – сумма всех лакун во всех 10 полях зрения.Доля пустых лакун относительно общего количества лакун в препаратахрассчитывалась по формулеZ = (z1 + z2 + … + z10) / 10Y,где Z – доля пустых лакун;(4)51(z1 + z2 +… + z10) – сумма всех пустых лакун во всех 10 полях зрения,1 / 10Y – коэффициент перерасчета абсолютного числа всех пустых лакун в долюк общему числу лакун в 10 полях зрения.Кроме того, был разработан алгоритм определения границ нормы дляколичества хрящевых лакун на участке препарата площадью 1245 × 934 мкм(площадь снимка камеры), что необходимо для последующего подсчета частотывстречаемости участков с пониженным и повышенным количеством хрящевыхлакун (гипо- и гиперлакунарные зоны) во всех трех исследуемых группах.
Дляопределения границ нормы в группе контроля было подсчитано среднееотносительное число лакун в 10 описанных выше снимках (полях зрения). Далее,с помощью методов математической статистики, к полученному результату былиопределены 95-процентные доверительные интервалы (ДИ 95 %). Таким образом,количество лакун в поле зрения ниже нижней границы ДИ 95 % (ужерассчитанной в группе контроля) во всех исследуемых группах считалосьгиполакунарной зоной, а выше верхней – гиперлакунарной зоной.Расчет границ 95-процентных доверительных интервалов (ДИ 95 %) длячастот встречаемости хрящевых каналов, гипо- и гиперлакунарных зон, а также –фокусов фибриллизации матрикса различных типов в группе контроля и в группепациентов с ВД и КД грудной клетки производили с помощью программы Excelстандартного пакета Microsoft Office 2010 по формуле [112]P ± 1,96 ∗ √ (P × (1 − P) N + 0,5 ) × 100 [%],где(5)P – выборочная доля (в долях единицы);N - общее число наблюдений.Оценка различий средней относительной площади участков АТ и хрящевыхканалов в трех группах осуществляли с использованием лицензионногостандартногопакетадвухфакторногопрограммдисперсионногоIBMSPSSанализаStatistics(ANOVA)20впосредствомкомбинациисапостериорным тестом Тьюки (Tukey’s post-hoc test).
Результаты были52представлены с 95-процентными доверительными интервалами (ДИ 95 %). Дляоценки корреляции между возрастом, степенью тяжести ДСТ, среднимколичеством лакун, долей пустых лакун, средней относительной площадьюразных типов фибриллизации матрикса и хрящевых каналов применялидвухсторонний критерий Спирмена при уровне значимости «р» равном 0,05.По результатам статистического исследования с помощью лицензионнойпрограммы GraphPad Prism 7 строили столбиковые диаграммы.53Глава 3. Морфологическая характеристика реберных хрящей у детей снормальной грудной клеткойПригистологическомисследованииреберныйхрящпредставленгиалиновой хрящевой тканью, покрытой снаружи надхрящницей (рисунки 3-5).Рисунок 3 – Строение реберного хряща в норме: надхрящница - Н,субперихондрий – СП, хрящевой канал – К, кровеносные сосуды – С,центральная зона хряща – ЦЗ: а) бесклеточный участок – звездочка (*),окраска гематоксилином и эозином, × 50; б) окраска пикросириусом красным,× 50; в) окраска по Маллори, × 50; г) окраска толуидиновым синим, × 50.Топографически в гиалиновой хрящевой ткани определяются две зоны,плавно переходящие друг в друга: субперихондрий, контактирующий снаружи снадхрящницей, и центральная зона, имеющая хондронную структуру (рисунки 3 –5).54Рисунок 4 – Строение реберного хряща в норме (фрагмент рис.
3а):надхрящница – Н (1 – фиброзный слой с коллагеновыми волокнами (КВ) ифибробластами (ФБЛ); 2 – хондрогенный слой с хондробластами (ХБЛ));нативный матрикс (НМ); субперихондрий (СП) с хондроцитами (ХЦ) внутрихрящевых лакун (Л); хрящевой канал (К); кровеносные и лимфатическиесосуды (С), окраска гематоксилином и эозином, × 400.Толщина надхрящницы вариабельна, в ее составе определяются два слоя:фиброзный и хондрогенный.
Фиброзный слой надхрящницы состоит измногочисленных, толстых коллагеновых волокон, формирующих пучки иимеющих характерные тинкториальные свойства (эозинофильны, при окраскепикросириусом красным они ярко-красные, при окраске по Маллори – темносиние, синие при окраске MAFT). Также в фиброзном слое встречаютсянемногочисленные зрелые фибробласты.55Рисунок 5 – Строение реберного хряща в норме: надхрящница – Н (1 –фиброзный слой с коллагеновыми волокнами (КВ) и фибробластами (ФБЛ);2 – хондрогенный слой с хондробластами (ХБЛ)); нативный матрикс (НМ);субперихондрий (СП) и центральная зона (ЦЗ) с хондроцитами (ХЦ) внутрихрящевых лакун (Л), полутонкий срез, окраска MAFT, × 200.Толуидиновым синим надхрящница не окрашивается, что свидетельствует онизком содержании в ней ГАГ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
