Диссертация (1091859), страница 12
Текст из файла (страница 12)
При соотношениифермент-субстрат 1/100 степень расщепления гибридного белка достигла максимальногозначения и при увеличении количества протеиназы выход реакции не увеличивался.Рис. 16. Степень расщепления гибридного белка при различном соотношении TEVпротеиназа/гибридный белок.Таким образом, 1:100 оказалось оптимальным соотношением фермент/субстрат. Притаких условиях расщепление гибридного белка происходило на 90% (Рис. 17).Рис. 17. Электрофоретический анализ продуктов протеолитического расщеплениягибридного белка Trx-TEVrs-TB4 TEV-протеиназой (см.
материалы и методы): М —маркеры молекулярной массы; Sup — супернатант после термической обработки; 1 —фракция после ионообменной хроматографии на Q Sepharose XL; 2 — фракция послестадии расщепления.2.2.1.5. Оптимизация и масштабирование стадии очистки дезацетилтимозина бета 4В лабораторной методике для отделения дезацетилтимозина бета 4 от остаточногобелка применялся метод тангенциальной ультрафильтрации при постоянном объёме [36].Однако с увеличением объёма разделяемой смеси значительно увеличилось времяпроцесса.
Поэтому для более эффективного разделения дезацетилтимозина бета 4 иостаточногобелказаменьшеевремя52вместоультрафильтрациииспользовалиионообменную хроматографию. В качестве носителя использовали катионообменнуюсмолу Macroprep High S компании BIO-RAD, так как по заявленным производителемхарактеристикам она обладала высокой ёмкостью и могла выдержать высокую скоростьпотока.Разделить дезацетилтимозин бета 4 от остаточного белка с помощью ионообменнойхроматографии, используя градиентную элюцию хлоридом натрия сложно из-за близкихизоэлектрических точек белков. Поэтому очистку дезацетилтимозина бета 4 проводили втри этапа (на всех этапах использовалась одна и таже колонна) (Рис.
18):1) На первом этапе колонну, уравновешенную 30мМ уксусной кислотой наносилиреакционную смесь после расщепления гибридного белка и элюировали смесь растворомJ. Элюат содержал дезацетилтимозин бета 4 и остаточный белок.2) На втором этапе колонну уравновешивали Буфером К со значением рН 5,2, элюаттакже титровали до 5,2, после наносили на колонну. При этом значении рНдезацетилтимозин бета 4 имел отрицательный заряд, поэтому не сорбировался накатионообменную смолу. Остаточный белок, наоборот, имел положительный заряд,поэтому полностью сорбировался.
Элюцию остаточного белка осуществляли Буфером L.3) На третьем этапе колонну регенерировали и уравновешивали Буфером Н созначением рН 3,0. Раствор, содержащий дезацетилтимозин бета 4, титровали до значениярН 3,0 и наносили на катионообменную смолу. Элюировали целевой продукт буфернымраствором с высокой ионной силой.1ЭлюцияНесорбировавшиесяпримеси1Уравновешиваниеколонны, рН 5,22Нанесение смесибелков1Нанесениереакционной смесиСмесь белковрН 3рН 5,2Разбавление3Нанесение иэлюцияСконцентрированныйдезацетилтимозин бета 43Уравновешиваниеколонны, рН 3,0рН 5,2рН 3Регенерация32Несорбировавшийсядезацетилтимозин бета 4Рис. 18. Технологическая схема процесса катионообменной хроматографии.532.2.1.6.
Оптимизация и масштабирование стадии ацетилированиядезацетилтимозина бета 4Оптимизациястадииацетилированиядезацетилтимозинабета4имелаисключительное значение, так как именно на этой стадии лабораторного методапроисходили наибольшие потери целевого пептида (Рис. 19).Рис. 19. Хроматографический профиль полупрепаративной ОФ ВЭЖХ продуктовацетилирования Тβ4 по лабораторной методике.Была исследована кинетика реакции ацетилирования.
Оказалось, что, после того какв реакционной смеси прореагировало более 50% дезацетилтимозина бета 4, значительноувеличивалась доля побочных продуктов реакции (Рис. 20). Нанесение реакционной смесинаколонну ОФВЭЖХосуществляличерезчаспосленачалареакции.Непрореагировавший дезацетилтимозин бета 4 повторно ацетилировали. Суммарный выходреакции по лабораторной методике ацетилирования [36] с учётом рецикла составил 7075% целевого пептида.Рис. 20. Зависимость количества вещества в реакционной смеси от времени реакцииацетилирования дезацетилтимозина бета 4 в лабораторных условиях: 1 —содержаниедезацетилтимозина бета 4; 2 — содержание побочных продуктов; 3 —содержание Tβ4.Условия реакции ацетилирования были отработаныв лабораторной методике,однако, после масштабирования реакции ацетилирования увеличилось время нанесенияреакционной смеси на колонну, что, в свою очередь, приводило к увеличению доли54побочных продуктов.
Таким образом, метод ацетилирования, описанный в статье [36],подходил только для объёма реакционной смеси до 100 мл. При большем объёмереакционной смеси значительно возрастали потери целевого пептида.С целью минимизировать потери были подобраны условия, при которых реакцияостанавливалась в момент достижения максимального выхода при доле побочныхпродуктов не больше 4%. В качестве терминаторов реакции исследовали коммерческидоступные малоновую и лимонную кислоты, которые способны образовывать устойчивыйкомплекс с молекулами белка и экранировать их.
Была определена зависимость долипобочных продуктов реакции от концентрации кислоты через час после её внесения вреакционную смесь (Рис. 21).Рис. 21. Доля побочных продуктов в реакционной смеси в зависимости от концентрациикислоты через 1 ч после ее добавления.Лимонная кислота уже при концентрации 10 мМ практически полностьюостанавливала реакцию ацетилирования, при той же концентрации малоновой кислотыреакция была остановлена лишь частично, поэтому от использования малоновой кислотыотказались.
Выход реакции по целевому пептиду с использованием лимонной кислотысоставил 55%, однако надо учитывать, что доля побочных продуктов каждой реакцииацетилирования теперь составляла не более 4%. Это дало возможность многократноацетилировать непрореагировавший дезацетилтимозин бета 4 с минимальными потерями(Рис. 22).55Рис. 22. Хроматографический профиль полупрепаративной ОФ ВЭЖХ продуктов реакцииацетилирования Тβ4 после оптимизации процесса.Была выведена формула для определения выхода реакции ацетилирования с учётомрециклов при фиксированном значении доли побочных продуктов.где W — суммарный максимальный выход реакции для n рециклов; f(x)= x – ax – bx;n — количество рециклов; х — исходное количество дезацетилтимозина бета 4; a —выход реакции по целевому продукту, b — доля побочных продуктов.Для n = 10, x = 10 000 мг , а = 55%, в = 4% имеем:W = 0,55(x + 0,41х + 0,1681х + 0,068921х + 0,028258х + 0,011586х + 0,00475х +0,001948х + 0,000798х + 0,000327х + 0,000134х) = 9321,5 мгДля 10 рециклов суммарный выход составил около 93,2% от теоретическивозможного.Таким образом, за счёт оптимизации технологии выделения целевого пептидапрактический выход увеличился с 3 до 5 мг с 1 г биомассы (таблица 3).
При этомсуммарный выход с учётом масштабирования и оптимизации технологии получения Tβ4увеличился с 20 до 80 мг с 1 л культуральной жидкости. Соответствующие результатыработы были получены совместно с Есиповым Р. С., Муравьевой Т.И., Степаненко В.Н.,Швецом В.И. и представлены в статье [162].56Таблица 3. Результаты оптимизации метода. Получение Tβ4 из 20 г биомассылабораторным методом и на основе пилотного производства.68085--Анионообменнаяхроматография(гибридный белок)Протеолитическоерасщепление гибридногобелка(дезацетилтимозин β4)Тангенциальнаяультрафильтрация припостоянном объёме(дезацетилтимозин β4)Суммарное ацетилированиес учётом 2 рециклов(Tβ4)ОФ ВЭЖХ(Tβ4)Итог(Tβ4)54480111908475637557905731Разрушение биомассы(гибридный белок)Температурная обработкаклеточного лизата(гибридный белок)Анионообменнаяхроматография(гибридный белок)Протеолитическоерасщепление гибридногобелка(дезацетилтимозин β4)Катионообменнаяхроматография(дезацетилтимозин β4)Суммарное ацетилированиес учётом 2 рециклов(Tβ4)ОФ ВЭЖХ(Tβ4)Итог(Tβ4)Выход,%Выход,%Разрушение биомассы(гибридный белок)-Пилотное производствоСтадияВыход,мгВыход,мгЛабораторный методСтадия760956849065095133901269511087999099552.2.2.
Разработка способов получения аналогов Tβ4 в виде конъюгатов, устойчивых кдеградации в токе кровиБиологическаяактивностьTβ4определяетсяегоактивнымисайтами,представляющими собой короткие пептидные последовательности [12]. В работе X. Li идр. [19] показано, что неацетилированная форма пептида также обладает полноценнойбиологической активностью, сопоставимой с биологической активностью нативного Tβ4.Литературные данные и, в первую очередь, тот факт, что ацетильная группа,присоединяемая в результате пострансляционной модификации к первой аминокислотеTβ4 - серину, никак не связана с биологической активностью пептида и необходиматолько для увеличения продолжительности его жизни в токе крови, свидетельствуют отом, что замена этой группы на другие стабилизирующие группы является наиболеелогичным подходом к разработке селективного способа получения аналогов Tβ4 спролонгированным временем жизни.572.2.2.1. Ацилирование дезацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислотыГексановая кислота обладает сильными гидрофобными свойствами: присоединениегексаноила к молекуле полипептида увеличивает его липофильные свойства и сродство кмембране [163].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
