Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1091859), страница 12

Файл №1091859 Диссертация (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов) 12 страницаДиссертация (1091859) страница 122018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 12)

При соотношениифермент-субстрат 1/100 степень расщепления гибридного белка достигла максимальногозначения и при увеличении количества протеиназы выход реакции не увеличивался.Рис. 16. Степень расщепления гибридного белка при различном соотношении TEVпротеиназа/гибридный белок.Таким образом, 1:100 оказалось оптимальным соотношением фермент/субстрат. Притаких условиях расщепление гибридного белка происходило на 90% (Рис. 17).Рис. 17. Электрофоретический анализ продуктов протеолитического расщеплениягибридного белка Trx-TEVrs-TB4 TEV-протеиназой (см.

материалы и методы): М —маркеры молекулярной массы; Sup — супернатант после термической обработки; 1 —фракция после ионообменной хроматографии на Q Sepharose XL; 2 — фракция послестадии расщепления.2.2.1.5. Оптимизация и масштабирование стадии очистки дезацетилтимозина бета 4В лабораторной методике для отделения дезацетилтимозина бета 4 от остаточногобелка применялся метод тангенциальной ультрафильтрации при постоянном объёме [36].Однако с увеличением объёма разделяемой смеси значительно увеличилось времяпроцесса.

Поэтому для более эффективного разделения дезацетилтимозина бета 4 иостаточногобелказаменьшеевремя52вместоультрафильтрациииспользовалиионообменную хроматографию. В качестве носителя использовали катионообменнуюсмолу Macroprep High S компании BIO-RAD, так как по заявленным производителемхарактеристикам она обладала высокой ёмкостью и могла выдержать высокую скоростьпотока.Разделить дезацетилтимозин бета 4 от остаточного белка с помощью ионообменнойхроматографии, используя градиентную элюцию хлоридом натрия сложно из-за близкихизоэлектрических точек белков. Поэтому очистку дезацетилтимозина бета 4 проводили втри этапа (на всех этапах использовалась одна и таже колонна) (Рис.

18):1) На первом этапе колонну, уравновешенную 30мМ уксусной кислотой наносилиреакционную смесь после расщепления гибридного белка и элюировали смесь растворомJ. Элюат содержал дезацетилтимозин бета 4 и остаточный белок.2) На втором этапе колонну уравновешивали Буфером К со значением рН 5,2, элюаттакже титровали до 5,2, после наносили на колонну. При этом значении рНдезацетилтимозин бета 4 имел отрицательный заряд, поэтому не сорбировался накатионообменную смолу. Остаточный белок, наоборот, имел положительный заряд,поэтому полностью сорбировался.

Элюцию остаточного белка осуществляли Буфером L.3) На третьем этапе колонну регенерировали и уравновешивали Буфером Н созначением рН 3,0. Раствор, содержащий дезацетилтимозин бета 4, титровали до значениярН 3,0 и наносили на катионообменную смолу. Элюировали целевой продукт буфернымраствором с высокой ионной силой.1ЭлюцияНесорбировавшиесяпримеси1Уравновешиваниеколонны, рН 5,22Нанесение смесибелков1Нанесениереакционной смесиСмесь белковрН 3рН 5,2Разбавление3Нанесение иэлюцияСконцентрированныйдезацетилтимозин бета 43Уравновешиваниеколонны, рН 3,0рН 5,2рН 3Регенерация32Несорбировавшийсядезацетилтимозин бета 4Рис. 18. Технологическая схема процесса катионообменной хроматографии.532.2.1.6.

Оптимизация и масштабирование стадии ацетилированиядезацетилтимозина бета 4Оптимизациястадииацетилированиядезацетилтимозинабета4имелаисключительное значение, так как именно на этой стадии лабораторного методапроисходили наибольшие потери целевого пептида (Рис. 19).Рис. 19. Хроматографический профиль полупрепаративной ОФ ВЭЖХ продуктовацетилирования Тβ4 по лабораторной методике.Была исследована кинетика реакции ацетилирования.

Оказалось, что, после того какв реакционной смеси прореагировало более 50% дезацетилтимозина бета 4, значительноувеличивалась доля побочных продуктов реакции (Рис. 20). Нанесение реакционной смесинаколонну ОФВЭЖХосуществляличерезчаспосленачалареакции.Непрореагировавший дезацетилтимозин бета 4 повторно ацетилировали. Суммарный выходреакции по лабораторной методике ацетилирования [36] с учётом рецикла составил 7075% целевого пептида.Рис. 20. Зависимость количества вещества в реакционной смеси от времени реакцииацетилирования дезацетилтимозина бета 4 в лабораторных условиях: 1 —содержаниедезацетилтимозина бета 4; 2 — содержание побочных продуктов; 3 —содержание Tβ4.Условия реакции ацетилирования были отработаныв лабораторной методике,однако, после масштабирования реакции ацетилирования увеличилось время нанесенияреакционной смеси на колонну, что, в свою очередь, приводило к увеличению доли54побочных продуктов.

Таким образом, метод ацетилирования, описанный в статье [36],подходил только для объёма реакционной смеси до 100 мл. При большем объёмереакционной смеси значительно возрастали потери целевого пептида.С целью минимизировать потери были подобраны условия, при которых реакцияостанавливалась в момент достижения максимального выхода при доле побочныхпродуктов не больше 4%. В качестве терминаторов реакции исследовали коммерческидоступные малоновую и лимонную кислоты, которые способны образовывать устойчивыйкомплекс с молекулами белка и экранировать их.

Была определена зависимость долипобочных продуктов реакции от концентрации кислоты через час после её внесения вреакционную смесь (Рис. 21).Рис. 21. Доля побочных продуктов в реакционной смеси в зависимости от концентрациикислоты через 1 ч после ее добавления.Лимонная кислота уже при концентрации 10 мМ практически полностьюостанавливала реакцию ацетилирования, при той же концентрации малоновой кислотыреакция была остановлена лишь частично, поэтому от использования малоновой кислотыотказались.

Выход реакции по целевому пептиду с использованием лимонной кислотысоставил 55%, однако надо учитывать, что доля побочных продуктов каждой реакцииацетилирования теперь составляла не более 4%. Это дало возможность многократноацетилировать непрореагировавший дезацетилтимозин бета 4 с минимальными потерями(Рис. 22).55Рис. 22. Хроматографический профиль полупрепаративной ОФ ВЭЖХ продуктов реакцииацетилирования Тβ4 после оптимизации процесса.Была выведена формула для определения выхода реакции ацетилирования с учётомрециклов при фиксированном значении доли побочных продуктов.где W — суммарный максимальный выход реакции для n рециклов; f(x)= x – ax – bx;n — количество рециклов; х — исходное количество дезацетилтимозина бета 4; a —выход реакции по целевому продукту, b — доля побочных продуктов.Для n = 10, x = 10 000 мг , а = 55%, в = 4% имеем:W = 0,55(x + 0,41х + 0,1681х + 0,068921х + 0,028258х + 0,011586х + 0,00475х +0,001948х + 0,000798х + 0,000327х + 0,000134х) = 9321,5 мгДля 10 рециклов суммарный выход составил около 93,2% от теоретическивозможного.Таким образом, за счёт оптимизации технологии выделения целевого пептидапрактический выход увеличился с 3 до 5 мг с 1 г биомассы (таблица 3).

При этомсуммарный выход с учётом масштабирования и оптимизации технологии получения Tβ4увеличился с 20 до 80 мг с 1 л культуральной жидкости. Соответствующие результатыработы были получены совместно с Есиповым Р. С., Муравьевой Т.И., Степаненко В.Н.,Швецом В.И. и представлены в статье [162].56Таблица 3. Результаты оптимизации метода. Получение Tβ4 из 20 г биомассылабораторным методом и на основе пилотного производства.68085--Анионообменнаяхроматография(гибридный белок)Протеолитическоерасщепление гибридногобелка(дезацетилтимозин β4)Тангенциальнаяультрафильтрация припостоянном объёме(дезацетилтимозин β4)Суммарное ацетилированиес учётом 2 рециклов(Tβ4)ОФ ВЭЖХ(Tβ4)Итог(Tβ4)54480111908475637557905731Разрушение биомассы(гибридный белок)Температурная обработкаклеточного лизата(гибридный белок)Анионообменнаяхроматография(гибридный белок)Протеолитическоерасщепление гибридногобелка(дезацетилтимозин β4)Катионообменнаяхроматография(дезацетилтимозин β4)Суммарное ацетилированиес учётом 2 рециклов(Tβ4)ОФ ВЭЖХ(Tβ4)Итог(Tβ4)Выход,%Выход,%Разрушение биомассы(гибридный белок)-Пилотное производствоСтадияВыход,мгВыход,мгЛабораторный методСтадия760956849065095133901269511087999099552.2.2.

Разработка способов получения аналогов Tβ4 в виде конъюгатов, устойчивых кдеградации в токе кровиБиологическаяактивностьTβ4определяетсяегоактивнымисайтами,представляющими собой короткие пептидные последовательности [12]. В работе X. Li идр. [19] показано, что неацетилированная форма пептида также обладает полноценнойбиологической активностью, сопоставимой с биологической активностью нативного Tβ4.Литературные данные и, в первую очередь, тот факт, что ацетильная группа,присоединяемая в результате пострансляционной модификации к первой аминокислотеTβ4 - серину, никак не связана с биологической активностью пептида и необходиматолько для увеличения продолжительности его жизни в токе крови, свидетельствуют отом, что замена этой группы на другие стабилизирующие группы является наиболеелогичным подходом к разработке селективного способа получения аналогов Tβ4 спролонгированным временем жизни.572.2.2.1. Ацилирование дезацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислотыГексановая кислота обладает сильными гидрофобными свойствами: присоединениегексаноила к молекуле полипептида увеличивает его липофильные свойства и сродство кмембране [163].

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6489
Авторов
на СтудИзбе
303
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее