Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1091859), страница 8

Файл №1091859 Диссертация (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов) 8 страницаДиссертация (1091859) страница 82018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 8)

На стадии обогащения было получено 4,5 лсупернатанта с концентрацией белка 6 г/л.2.1.1.8. Хроматографическая очистка гибридного белкаПолученный супернатант разделяли на две равные порции и поочерёднохроматографировали. Каждую порцию разбавляли в 10 раз дистиллированной водой инаносили с помощью хроматографической системы AKTA Pilot (GE, США) со скоростью15 мл/мин на колонну XK 50/75 (GE,США), заполненную сорбентом Q Sepharose XLобъёмом 700 мл, уравновешенную перед нанесением двумя объёмами буфера А. Колоннууравновешивали 2 объёмами Буфера B, элюировали гибридный белок со скоростью 25мл/мин 2 объёмами Буфера C.

Концентрацию белка в элюате измеряли с помощьюспектрофотометра U – 2900 (Hitachi, Япония) по методу Бредфорда [152]. Было получено3 л объединённого элюата с концентрацией белка 5 г/л. Оставшиеся на колонне белкиэлюировали 100% Буфером D.2.1.1.9. Подготовка телец включения TEV-протеиназыТельца включения TEV-протиназы, полученные методом, описанным в статье [36],суспензировали в Буфере E, полученную суспензию центрифуговали на центрифуге33Z383K Hermle Labor Technik (Германия) при 11500 об/мин, 40 мин, 5ºС. Супернатантдекантировали, а осадок ресуспензировали в дистиллированной воде, центрифугировали исольюбилизировали в Буфере F.2.1.1.10. Поиск оптимального соотношения фермент/субстрат протеолитическогорасщепления гибридного белкаПоиск оптимальных условий реакции расщепления проводили в 30 мл Буфера G сконцентрацией гибридного белка 5 мг/мл. Было проведено 6 реакций с соотношениемфермент/субстрат: 1/400, 1/300, 1/200, 1/100, 1/50, 1/25.

Исходный раствор TEV –протеиназысконцентрацией2,5мг/млдобавляликаплямиприпостоянномперемешивании. Все реакции проводили при постоянной температуре 30ºС. Через 16 ч изкаждой реакции отобирали пробы на анализ.2.1.1.11. Масштабирование реакции протеолитического расщепления гибридногобелкаВ элюат объёмом 3 л с концентрацией гибридного белка 5 г/л добавляли приперемешивании дитиотреитол до конечной концентрации 3 мМ и 60 мл 2,5 мг/мл раствораTEV-протеиназы при 300С. Реакционную смесь инкубировали в течение 16 ч.2.1.1.12. Хроматографическое разделение дезацетилтимозина бета 4 и остаточногобелкаВ работе использовали хроматографическую систему Akta Pilot (GE, США).

Послеферментативного расщепления реакционную смесь титровали раствором 5М CH3COOHдо значения pH 3,0. Центрифугировали на центрифуге Avanti J-30I (Beckman Coulter,США) при 4500 об/мин, 1,5 ч, 5ºС и супернатант разбавляли в 10 раз дистиллированнойводой. Раствор наносили со скоростью 50 мл/мин на колоннy BPG 100/500 (GE, США),заполненную сорбентом Macroprep High S (BIO-RAD, США) объёмом 1500 мл, которыйперед нанесением был уравновешен сначала одним объёмом Раствора J, а затем 2объёмами Раствора Н. После нанесения колонну уравновешивали 2 объёмами Раствора Hи элюировали сорбировавшиеся на колонне вещества 2 объёмами Раствора J со скоростью100 мл/мин.

Элюат разбавляли в 10 раз дистиллированной водой и титровали до значенияpH 5,2 раствором 5 М NaOH и наносили на колонну, предварительно уравновешенную 2объёмами Буфера К. По окончанию нанесения колонну уравновешивали 2 объёмамиБуфера К. pH элюата, образовавшегося в ходе нанесения и уравновешивания колонныРаствором J, титровали до значения рН 3,0 раствором 5 М CH3COOH и снова наносили на34колонну, урановешенную сначала 2 объёмами Буфера L, а затем 2 объёмами Раствора H.По окончании нанесения колонну урановешивали 2 объёмами Раствора H и целевоевещество элюировали 2 объёмами Буфера L.2.1.1.13. Определение условий ингибирования реакции ацетилированиядезацетилтимозина бета 4Приготавливали 10 образцов раствора дезацетилтимозина бета 4 с концентрацией 1мг/мл и значением рН 3.

К каждому раствору при перемешивании добавляли уксусныйангидрид в объёмном соотношении 1:100. Реакции инкубировали при 23ºС в течение 60мин. Затем, в одну из реакционных смесей добавляли лимонную кислоту до конечнойконцентрации 1 мМ, во вторую - до 5 мМ, в третью - до 10 мМ, в четвёртую - 50 мМ, впятую - до 100 мМ. В оставшиеся пять добавляли малоновую кислоту до тех же конечныхконцентраций.

Через каждые 20 мин в течение часа реакционные смеси анализировали спомощью аналитической ОФ ВЭЖХ для определения доли побочных продуктов реакции.2.1.1.14. Масштабирование реакции ацетилирования дезацетилтимозина бета 4 иочистка продуктов реакции на ОФ ВЭЖХК 900 мл раствора дезацетилтимозина бета 4 с концентраций белка 1 мг/мл припостоянном перемешивании добавляли уксусный ангидрид в объёмном соотношении1:100 и оставляли перемешиваться при 23ºС в течение 60 мин. Затем в реакционную смесьдобавляли раствор лимонной кислоты до конечной концентрации 10 мМ и наносили наколонку Kromasil300-10-C18, 50x250 мм (GMBH, Германия).

Элюцию компонентовсмеси производили в градиенте концентрации 80% ацетонитрила (15–25% в течение 60мин) в 0,1% CF3COOH при скорости потока 50 мл/мин. Фракции, содержащие Tβ4чистотой более 98%, объединяли и лиофильно высушивали. Фракции, содержащие Tβ4чистотой менее 98%, объединяли и замораживали для повторной очистки.2.1.1.15. Аналитические методы контроляЭлектрофоретическое разделение белков производили на электрофоретическойсистеме PowerPac HC (BIO-RAD, США) в 15% ПААГ по Лэммли [153]. Гели окрашивалираствором Coumassi R-250 (2,5 мг/мл). Анализ фракций, содержащих дезацетилтимозинβ4, осуществляли с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке Prosphere C18 300 A 5µ (Alltech,США). Пептидные продукты элюировали в градиенте концентрации ацетонитрила (5–90%, 23 мин) в 0,1% TFA со скоростью 0,75 мл/мин при 25°С. Масс-спектрометрическийанализ проводили на приборе 6224 TOF LC/MS (Agilent technologies, США).352.1.2.

Разработка способов получения аналогов Tβ4 в виде конъюгатов, устойчивых кдеградации в токе крови2.1.2.1. МатериалыВ работе использовали очищенный рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4человека, ранее полученный в лаборатории биотехнологии ИБХ РАН [36], цианборгидриднатрия (Sigma-Aldrich, США), бутанол (Panreac, Испания), ацетонитрил (Panreac,Испания), ледяную уксусную кислоту (Panreac, Испания), ацетат натрия (Panreac,Испания), гидроксид натрия (Panreac, Испания) и трифторуксусную кислоту (SigmaAldrich,США).Вкачествемодифицирующихагентовиспользовалилинейноеактивированное пропиональдегидное производное ПЭГ с молекулярной массой 10 кДаSUNBRIGHTME-100AL(NOFCorporation,США);линейноеактивированноебутиральдегидное производное полисиаловой кислоты со средней молекулярной массой14 кДА, полученное от Lipoxen Facilities (Англия); ангидрид гексановой кислоты (SigmaAldrich, США) и Asp-N-протеиназу из мутантного штамма Pseudomonas fragi (SigmaAldrich, США).

Coumassi R-250 получали от Bio-Rad, США; иодид бария − от SigmaAldrich, США.2.1.2.2. Подбор условий проведения реакции ацилирования дезацетилтимозина бета 4ангидридом гексановой кислотыК 1 мл буферного раствора (50 мМ ацетата натрия,0−30% ацетонитрила, 0−30%бутанола, рН 3,0; 4,5; 6,0), содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 вконцентрации 1мг/мл, добавляли 2,25 мкл ангидрида гексановой кислоты (мольноесоотношение 1:50).

Реакцию проводили при 25°С и тщательном перемешивании в течение5 ч. Контроль образования моногексаноилтимозина бета 4 проводили с использованиемметода ОФ ВЭЖХ.2.1.2.3. Масштабирование реакции ацилирования деацетилтимозина бета 4ангидридом гексановой кислотыК 10 мл раствора (30 мМ CH3COOH, 30% ацетонитрила, 15% бутанола, рН 3,0),содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1 мг/мл,добавляли 22,5 мкл ангидрида гексановой кислоты (мольное соотношение 1:50).

Реакциюпроводили при 25°С и тщательном перемешивании в течение 3 ч. Контроль образованиямоногексаноилтимозина бета 4 проводили с использованием метода ОФ ВЭЖХ.362.1.2.4. Очистка моногексаноилтимозина бета 4Реакционную смесь объемом 10 мл разбавляли в 10 раз дистиллированной водой инаносили на колонну «Диасорб» 130 С16Т, 8 мкм, 15 × 250 мм. Разделение проводили вградиенте смеси 80%-ного ацетонитрила с 0,1%-ной ТФУ (15−30% за 60 мин) соскоростью 3,5 мл/мин. Фракции, содержащие более 98% моногексаноилтимозина бета 4,объединяли и лиофилизовали.2.1.2.5. Подбор условий проведения реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4К 1 мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, 0−30% ацетонитрила, рН 3,0; 4,0;5,0; 6,0), содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1 мг/мл,добавляли 8 мг цианборгидрида натрия и от 2,8 до 28 мг (с шагом в 2,8 мг)бутиральдегидного производного полисиаловой кислоты (конечное мольное соотношениебелок – ПСК = 1-2;1-3;1-4;1-5;1-6;1-7;1-8,1-9,1-10) и инкубировали при 25°С и тщательномперемешивании в течение 5 ч.

Образование конъюгата полисиаловой кислоты с Tβ4контролировали с использованием методов ОФ ВЭЖХ и SDS-электрофореза в 15%-номПААГ по Лэммли [153].2.1.2.6. Масштабирование реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4К 10 мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, 30% ацетонитрила, рН 4,5),содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1 мг/мл,добавляли 80 мг цианборгидрида натрия и 140 мг бутиральдегидного производногополисиаловой кислоты (мольное соотношение 1:5). Реакционную смесь тщательноперемешивали и инкубировали в течение 3 ч при 25°С. Контроль образованиямоносиалированного Tβ4 осуществляли с использованием метода ОФ ВЭЖХ.2.1.2.7. Очистка моносиалированного Tβ4Реакционную смесь объемом 10 мл разбавляли дистиллированной водой в 10 раз инаносили на колонну «Диасорб» 130 С16Т, 8 мкм, 15 × 250мм.

Разделение проводили вградиенте смеси 80%-ного ацетонитрила (8−23% за 60 мин) с 1% NH4OAc со скоростью3,5 мл/мин. Фракции, содержащие более 98% моносиалированного Tβ4, объединяли илиофилизовали.372.1.2.8. Подбор условий проведения реакции ПЭГилирования дезацетилтимозинабета 4К 1 мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, 0−30% ацетонитрила, рН 3,0; 4,5;6,0), содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1 мг/мл,добавляли 8 мг цианборгидрида натрия и от 2 до 10 мг (с шагом в 1 мг)пропиональдегидного производного ПЭГ (конечное мольное соотношение белок − ПЭГ =1−5 с шагом 0,5).

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6353
Авторов
на СтудИзбе
311
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее