Диссертация (1091859), страница 8
Текст из файла (страница 8)
На стадии обогащения было получено 4,5 лсупернатанта с концентрацией белка 6 г/л.2.1.1.8. Хроматографическая очистка гибридного белкаПолученный супернатант разделяли на две равные порции и поочерёднохроматографировали. Каждую порцию разбавляли в 10 раз дистиллированной водой инаносили с помощью хроматографической системы AKTA Pilot (GE, США) со скоростью15 мл/мин на колонну XK 50/75 (GE,США), заполненную сорбентом Q Sepharose XLобъёмом 700 мл, уравновешенную перед нанесением двумя объёмами буфера А. Колоннууравновешивали 2 объёмами Буфера B, элюировали гибридный белок со скоростью 25мл/мин 2 объёмами Буфера C.
Концентрацию белка в элюате измеряли с помощьюспектрофотометра U – 2900 (Hitachi, Япония) по методу Бредфорда [152]. Было получено3 л объединённого элюата с концентрацией белка 5 г/л. Оставшиеся на колонне белкиэлюировали 100% Буфером D.2.1.1.9. Подготовка телец включения TEV-протеиназыТельца включения TEV-протиназы, полученные методом, описанным в статье [36],суспензировали в Буфере E, полученную суспензию центрифуговали на центрифуге33Z383K Hermle Labor Technik (Германия) при 11500 об/мин, 40 мин, 5ºС. Супернатантдекантировали, а осадок ресуспензировали в дистиллированной воде, центрифугировали исольюбилизировали в Буфере F.2.1.1.10. Поиск оптимального соотношения фермент/субстрат протеолитическогорасщепления гибридного белкаПоиск оптимальных условий реакции расщепления проводили в 30 мл Буфера G сконцентрацией гибридного белка 5 мг/мл. Было проведено 6 реакций с соотношениемфермент/субстрат: 1/400, 1/300, 1/200, 1/100, 1/50, 1/25.
Исходный раствор TEV –протеиназысконцентрацией2,5мг/млдобавляликаплямиприпостоянномперемешивании. Все реакции проводили при постоянной температуре 30ºС. Через 16 ч изкаждой реакции отобирали пробы на анализ.2.1.1.11. Масштабирование реакции протеолитического расщепления гибридногобелкаВ элюат объёмом 3 л с концентрацией гибридного белка 5 г/л добавляли приперемешивании дитиотреитол до конечной концентрации 3 мМ и 60 мл 2,5 мг/мл раствораTEV-протеиназы при 300С. Реакционную смесь инкубировали в течение 16 ч.2.1.1.12. Хроматографическое разделение дезацетилтимозина бета 4 и остаточногобелкаВ работе использовали хроматографическую систему Akta Pilot (GE, США).
Послеферментативного расщепления реакционную смесь титровали раствором 5М CH3COOHдо значения pH 3,0. Центрифугировали на центрифуге Avanti J-30I (Beckman Coulter,США) при 4500 об/мин, 1,5 ч, 5ºС и супернатант разбавляли в 10 раз дистиллированнойводой. Раствор наносили со скоростью 50 мл/мин на колоннy BPG 100/500 (GE, США),заполненную сорбентом Macroprep High S (BIO-RAD, США) объёмом 1500 мл, которыйперед нанесением был уравновешен сначала одним объёмом Раствора J, а затем 2объёмами Раствора Н. После нанесения колонну уравновешивали 2 объёмами Раствора Hи элюировали сорбировавшиеся на колонне вещества 2 объёмами Раствора J со скоростью100 мл/мин.
Элюат разбавляли в 10 раз дистиллированной водой и титровали до значенияpH 5,2 раствором 5 М NaOH и наносили на колонну, предварительно уравновешенную 2объёмами Буфера К. По окончанию нанесения колонну уравновешивали 2 объёмамиБуфера К. pH элюата, образовавшегося в ходе нанесения и уравновешивания колонныРаствором J, титровали до значения рН 3,0 раствором 5 М CH3COOH и снова наносили на34колонну, урановешенную сначала 2 объёмами Буфера L, а затем 2 объёмами Раствора H.По окончании нанесения колонну урановешивали 2 объёмами Раствора H и целевоевещество элюировали 2 объёмами Буфера L.2.1.1.13. Определение условий ингибирования реакции ацетилированиядезацетилтимозина бета 4Приготавливали 10 образцов раствора дезацетилтимозина бета 4 с концентрацией 1мг/мл и значением рН 3.
К каждому раствору при перемешивании добавляли уксусныйангидрид в объёмном соотношении 1:100. Реакции инкубировали при 23ºС в течение 60мин. Затем, в одну из реакционных смесей добавляли лимонную кислоту до конечнойконцентрации 1 мМ, во вторую - до 5 мМ, в третью - до 10 мМ, в четвёртую - 50 мМ, впятую - до 100 мМ. В оставшиеся пять добавляли малоновую кислоту до тех же конечныхконцентраций.
Через каждые 20 мин в течение часа реакционные смеси анализировали спомощью аналитической ОФ ВЭЖХ для определения доли побочных продуктов реакции.2.1.1.14. Масштабирование реакции ацетилирования дезацетилтимозина бета 4 иочистка продуктов реакции на ОФ ВЭЖХК 900 мл раствора дезацетилтимозина бета 4 с концентраций белка 1 мг/мл припостоянном перемешивании добавляли уксусный ангидрид в объёмном соотношении1:100 и оставляли перемешиваться при 23ºС в течение 60 мин. Затем в реакционную смесьдобавляли раствор лимонной кислоты до конечной концентрации 10 мМ и наносили наколонку Kromasil300-10-C18, 50x250 мм (GMBH, Германия).
Элюцию компонентовсмеси производили в градиенте концентрации 80% ацетонитрила (15–25% в течение 60мин) в 0,1% CF3COOH при скорости потока 50 мл/мин. Фракции, содержащие Tβ4чистотой более 98%, объединяли и лиофильно высушивали. Фракции, содержащие Tβ4чистотой менее 98%, объединяли и замораживали для повторной очистки.2.1.1.15. Аналитические методы контроляЭлектрофоретическое разделение белков производили на электрофоретическойсистеме PowerPac HC (BIO-RAD, США) в 15% ПААГ по Лэммли [153]. Гели окрашивалираствором Coumassi R-250 (2,5 мг/мл). Анализ фракций, содержащих дезацетилтимозинβ4, осуществляли с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке Prosphere C18 300 A 5µ (Alltech,США). Пептидные продукты элюировали в градиенте концентрации ацетонитрила (5–90%, 23 мин) в 0,1% TFA со скоростью 0,75 мл/мин при 25°С. Масс-спектрометрическийанализ проводили на приборе 6224 TOF LC/MS (Agilent technologies, США).352.1.2.
Разработка способов получения аналогов Tβ4 в виде конъюгатов, устойчивых кдеградации в токе крови2.1.2.1. МатериалыВ работе использовали очищенный рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4человека, ранее полученный в лаборатории биотехнологии ИБХ РАН [36], цианборгидриднатрия (Sigma-Aldrich, США), бутанол (Panreac, Испания), ацетонитрил (Panreac,Испания), ледяную уксусную кислоту (Panreac, Испания), ацетат натрия (Panreac,Испания), гидроксид натрия (Panreac, Испания) и трифторуксусную кислоту (SigmaAldrich,США).Вкачествемодифицирующихагентовиспользовалилинейноеактивированное пропиональдегидное производное ПЭГ с молекулярной массой 10 кДаSUNBRIGHTME-100AL(NOFCorporation,США);линейноеактивированноебутиральдегидное производное полисиаловой кислоты со средней молекулярной массой14 кДА, полученное от Lipoxen Facilities (Англия); ангидрид гексановой кислоты (SigmaAldrich, США) и Asp-N-протеиназу из мутантного штамма Pseudomonas fragi (SigmaAldrich, США).
Coumassi R-250 получали от Bio-Rad, США; иодид бария − от SigmaAldrich, США.2.1.2.2. Подбор условий проведения реакции ацилирования дезацетилтимозина бета 4ангидридом гексановой кислотыК 1 мл буферного раствора (50 мМ ацетата натрия,0−30% ацетонитрила, 0−30%бутанола, рН 3,0; 4,5; 6,0), содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 вконцентрации 1мг/мл, добавляли 2,25 мкл ангидрида гексановой кислоты (мольноесоотношение 1:50).
Реакцию проводили при 25°С и тщательном перемешивании в течение5 ч. Контроль образования моногексаноилтимозина бета 4 проводили с использованиемметода ОФ ВЭЖХ.2.1.2.3. Масштабирование реакции ацилирования деацетилтимозина бета 4ангидридом гексановой кислотыК 10 мл раствора (30 мМ CH3COOH, 30% ацетонитрила, 15% бутанола, рН 3,0),содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1 мг/мл,добавляли 22,5 мкл ангидрида гексановой кислоты (мольное соотношение 1:50).
Реакциюпроводили при 25°С и тщательном перемешивании в течение 3 ч. Контроль образованиямоногексаноилтимозина бета 4 проводили с использованием метода ОФ ВЭЖХ.362.1.2.4. Очистка моногексаноилтимозина бета 4Реакционную смесь объемом 10 мл разбавляли в 10 раз дистиллированной водой инаносили на колонну «Диасорб» 130 С16Т, 8 мкм, 15 × 250 мм. Разделение проводили вградиенте смеси 80%-ного ацетонитрила с 0,1%-ной ТФУ (15−30% за 60 мин) соскоростью 3,5 мл/мин. Фракции, содержащие более 98% моногексаноилтимозина бета 4,объединяли и лиофилизовали.2.1.2.5. Подбор условий проведения реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4К 1 мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, 0−30% ацетонитрила, рН 3,0; 4,0;5,0; 6,0), содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1 мг/мл,добавляли 8 мг цианборгидрида натрия и от 2,8 до 28 мг (с шагом в 2,8 мг)бутиральдегидного производного полисиаловой кислоты (конечное мольное соотношениебелок – ПСК = 1-2;1-3;1-4;1-5;1-6;1-7;1-8,1-9,1-10) и инкубировали при 25°С и тщательномперемешивании в течение 5 ч.
Образование конъюгата полисиаловой кислоты с Tβ4контролировали с использованием методов ОФ ВЭЖХ и SDS-электрофореза в 15%-номПААГ по Лэммли [153].2.1.2.6. Масштабирование реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4К 10 мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, 30% ацетонитрила, рН 4,5),содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1 мг/мл,добавляли 80 мг цианборгидрида натрия и 140 мг бутиральдегидного производногополисиаловой кислоты (мольное соотношение 1:5). Реакционную смесь тщательноперемешивали и инкубировали в течение 3 ч при 25°С. Контроль образованиямоносиалированного Tβ4 осуществляли с использованием метода ОФ ВЭЖХ.2.1.2.7. Очистка моносиалированного Tβ4Реакционную смесь объемом 10 мл разбавляли дистиллированной водой в 10 раз инаносили на колонну «Диасорб» 130 С16Т, 8 мкм, 15 × 250мм.
Разделение проводили вградиенте смеси 80%-ного ацетонитрила (8−23% за 60 мин) с 1% NH4OAc со скоростью3,5 мл/мин. Фракции, содержащие более 98% моносиалированного Tβ4, объединяли илиофилизовали.372.1.2.8. Подбор условий проведения реакции ПЭГилирования дезацетилтимозинабета 4К 1 мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, 0−30% ацетонитрила, рН 3,0; 4,5;6,0), содержащего рекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1 мг/мл,добавляли 8 мг цианборгидрида натрия и от 2 до 10 мг (с шагом в 1 мг)пропиональдегидного производного ПЭГ (конечное мольное соотношение белок − ПЭГ =1−5 с шагом 0,5).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
