Отзыв ведущей организации (1091845)
Текст из файла
ФАНО РОССИИ ФЕДЕРДЯЬНОЕ ГОСУДДРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОссийскОЙ дкддевии нАук 1231 82 Москва, пл. Акад. Курчатова, д. 2 Тал. (499П96.0000, Факс (499)196.0221, аккчкклд.таа.то, ЕчлаК: алд©алдтавто ИНН~КПП 773402167й773401001, ОКПО 04683332, ОГРН 1027739480966 и На № учной работе генетики РАН некий ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ на диссертационную работу Макарова Дмитрии Александровича «Разработка технологий получении рекомбинантного тимознна бета-4 человека и его аналогов», представленную на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 03.01.0б— Биотехнологии (в том числе бионанотехнологи~) Ж1т.1ыьиость. Диссертантом Макаровым Д.А.
была проведена научно- квалификационная работа, тема которой в настоящее время является крайне актуальной, поскольку обусловлена необходимостью разработки методов ' получения многофункционального рекомбииантного пептида тнмозина бета-4 (ТР4) человека, принимающего участие в стимулировании ангиогенеза в условиях ишемии сердечной мышцы, блокирующего в кардиомиоцнтах проапоптотические каскады и, наоборот, активизирующего внугриклеточные сигнальные пути, ответственные за выживаемость клеток в условиях стресса. Активность этой молекулы также проявляется прн лечении трофических язв, ран и ожогов роговицы глаза человека.
Благодаря противовоспалительным свойствам ТР4 зарекомендовал себя как действующее вещество в препаратах для лечения признаков воспаления кожи— хронических дерматитов. Таким образом, ТР4 обладает высоким терапевтическим потенциалом для применения в качестве лекарственного препарата прн лечении широкого спектра заболеваний. В мировой практике часто применяются методы химической модификации фармацевтических белков, для того чтобы улучшить нх фармакокинетические показатели, поэтому важным является вопрос получения аналогов ТР4 с пролонгированным действием.
Со е жаиие аботы. Рецензируемая работа изложена на 100 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Во введении диссертант обосновывает выбор темы и еб актуальность, определяет цель и задачи работы, формулирует цель и задачи исследования, раскрывает научную новизну и практическую значимость диссертационной работы, указывает количество публикаций и апробаций по результатам исследований. Представленный обзор литературы отличается полнотой и непосредственно связан с темой исследования.
Обзор литературы посвящен описанию молекулы Тр4 человека, еб физико- химическим и биологическим свойствам, а также описаны все возможные способы ед получения на сегодняшний день. В начальных главах литературного обзора описана история открытия семьи бета тимозинов, их свойства и конкретно Тр4, его структура, способы получения и биологическая активность. В заключительных главах проведен обзор молекулярных механизмов, регулируемых активностью Т~34, способы доставки Тр4 к тканям, отдельная глава посвящена сульфоксиду Т~34 и его биологической активности. Также в заключительной части обзора литературы присутствуют главы, объясняющие многофункциональные свойства пептида и способы его применения.
В целом, обзор дает полное представление о пептиде Тр4 и способах его получения и служит хорошим введением к изложению собственных результатов автора. В экспериментальной части автором приведены современные методы выделения и очистки рекомбинантных белков, а также аналитические методы, используемые в диссертационной работе.
Подробно и последовательно описаны ключевые методики по наращиванию биомассы, выделению целевого гибридного белка и его расщепления, пробоподготовке субстанций, химической модификации белков, а также методика проведения хроматографии. Все представленные данные получены Макаровым Д.А. в результате корректно выполненных и подробно изложенных экспериментов. Часть «результаты и обсуждение» включает разделы, которые отражают последовательное выполнение обозначенных диссертантом задач, На первом этапе исследований Макаровым Д.А. была оптимизирована и масштабирована лабораторная методика получения Т~34.
Разработан лабораторный регламент получения рекомбинантного пептида, позволяющий получить 80 мг целевого пептида с 1 л культуральной жидкости. В ходе оптимизации лабораторная методика подверглась значительным изменениям, так, например, культивирование вместо качалочных колб проводили в 250 л ферментере, что привело к значительному увеличению выхода биомассы. Добавлена стадия термического осаждения балластных белков, приведшая к обогащению клеточного лизата гибридным белком, что в свою очередь увеличило эффективность анионообменной хроматографии.
Неэффективная тангенциальная ультрафильтрация, использующаяся в лабораторной методике для разделения целевого пептида и остаточного белка, заменена на более эффективную ионообменную хроматографию. Оптимизирован процесс химического ацетнлирования Т~34, подобраны такие условия, при которых потери целевого пептида были минимальны. Таким образом, результатом оптимизации лабораторной методики стало увеличение выхода Тр4 в 4 раза, результатом масштабирования оптимизированной лабораторной методики стало создание пилотного производства Тр4, с помощью которого диссертантом было получено 2,5 г целевого пептида.
Во второй части работы Макаровым Д.А. описана разработка региоселективной модификации Т~34 по Х-концевой альфа аминогруппе. Подобраны условия проведения реакций, при которых молекула Тр4 селективно модифицировалась по 1Ч-концевой альфа аминогруппе. В результате проведбнной работы диссертантом были получены конъюгаты Т~34 с полисиаповой кислотой, полнэтиленгликолем и капроновой кислотой. Разработаны методики очистки полученных аналогов. Доказана структура полученных аналогов и показано их пролонгированное действие в сыворотке крови.
В третье части работы Макаровым Д.А. показана принципиально новая технология получения Тр4 с ацетилированием пептида к ию, основанная на интеин-опосредованной экспрессионной системе. Гены Т~34 и сериковой или аланнновой Х-концевых ацетилтрансфераз Е. сой были клонированы в полнцистронную конструкцию под контроль сильного Т7 промотора. В результате экспрессии данной конструкции синтезировались гибридный белок, содержащий Тр4, мини-интеин бугА и хитин связывающий домен, а также сериновая или аланиновая ацетилтрансферазы. В ходе постгрансляционной модификации с Х-конца гибридного белка полностью отщеплялся формилметионин, а М-концевой серии подвергался ацетилироваиию. Были подобраны такие условия культивирования, при которых выход ацетилнрованного пептида достигал 93%. В четвертой части работы исследовалась эффективность полученного рекомбинантного Тр4 на спонтанной мьппиной модели хронического дерматита.
В ходе работы было показано, что местная обработка кожи спины мышей рекомбинантным Тр4 способствовала достоверному ослаблению симптомов хронического дерматита и дала долгосрочный терапевтический эффект в оригинальной спонтанной мьппиной модели дерматита человека. На наи новизна п ве енных весле ованнй и по ченных льтатов Макаровым Д.А впервые разработана эффективная н легко масштабируемая технология получения рекомбинантного Т~34 человека с использованием интеин-опосредованной экспрессионной системы, обеспечивающая селективное высокоэффективное ацетилирование рекомбинантного Тр4 1л ию.
Исследована биологическая активность рекомбинантного Т~34 человека на спонтанной мышиной модели хронического дерматита и показана его эффективность в лечении хронических заболеваний кожи. Синтезированы три аналога рекомбинантного Т~34 человека с улучшенными фармакокинетическими показателями. Разработан эффективный способ очистки аналогов рекомбинантного Т~34 человека с использованием методов ОФ ВЭЖХ.
П оптическая значимость ез льтатов п ченпых нсее тантом. Диссертантом Макаровым Д.А. успешно разработан лабораторный регламент получения рекомбинантного Т~34 человека. В итоге на основе пилотного производства получена опытная партия Тр4 в количестве 2,5 г с фармацевтической чистотой для доклинических исследований.
Главным практически значимым результатом разработанного способа ацетилирования Т~34 гп ию стало уменьшение затрат времени и реактивов на очистку целевого пептида. Ап ба и иеее та ии. Результаты диссертационной работы Макарова Д.А. представлены на различных международных научно-практических конференциях.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях, получено 4 патента. Рекоме ии по п актичееко использованию ез льтатов и выво ов аботы. Данные, полученные диссертантом Макаровым Д.А., могут быть использованы различными разработчиками и производителями фармацевтических субстанций, использующих в своих разработках технологию рекомбинантных ДНК на основе штаммов продуцентов Е. сой. Результаты могут быть использованы при проведении научных исследований в Институте молекулярной генетики РАН, Институте биохимии им. А.Н.
Баха РАН, Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Государственном научноисследовательском институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Замечания. По материалам диссертации можно сделать ряд замечаний: 1. В диссертации в процессе оптимизации лабораторной методики получения ТР4 осаждение балластных белков было осуществлено за счет термической обработки осветленного клеточного лизата.
Однако это не единственный из известных способ осаждения белков. К наиболее часто используемым методам также относятся, например, высаливание или осаждение белков за счбт изменение рН раствора. К сожалению, работа с этими методиками не была проведена, хотя возможно привела бы к более высоким результатам. 2. В главе «Оптимизация и масштабирование стадии очистки дезацетилтимозина бета 4» сложно для понимания описан процесс хроматографической очистки целевого пептнда от остаточных белков.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.