Диссертация (1091859), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Клеткиштамма С3030, относящиеся к электрокомпетентным клеткам, с помощью пипеткипереносили в специальную ячейку для электропорации от компании Bio-Rad (США),параметры электропорации: 1.8 кВ, 25µF, 200 Ом, зазор ячейки 0,1 см, время импульса3.9-4.6 мс. Трансформанты высевали на агаризованную среду с ампицилином и растералистеклянным шпателем. Все действия проводились под ламинаром в стерильных условиях,шпатель перед использованием стерилизовали в пламени горелки.462.1.4. Эффективность рекомбинантного Tβ4 в спонтанной мышиной моделихронического дерматита2.1.4.1.
МатериалыВ работе использовали очищенный рекомбинантный Tβ4 человека, ранееполученный в лаборатории биотехнологии ИБХ РАН, противогрибковый спрей длянаружного применения Зоомиколь (Балканфарма, Болгария), антибактериальный препаратБайтрил 5% (Байер, Россия), глицерин (Panreac, Испания). Исследование было проведенона стареющих девственных самках мышей линии CBRB-Rb(8,17)1Iem (CBRB [156]), n=26)с симптомами хронического воспалительного поражения кожи спины (изъязвлением иалопецией) двух возрастных подгрупп, а именно: относительно молодых (n=17, возраст14,7±0,2 недель, вес 21,9±0,3 г) и старых (n=9, возраст 55,2±0,9 недель, вес 24,2±0,6 г)самок.2.1.4.2.
Определение эффективности рекомбинантного Tβ4 в спонтанной мышиноймодели хронического дерматитаЖивотныхсодержаливотделениибиомоделейвиварияИБХРАНвконвенциональных условиях при обычном световом режиме, кормили стандартнымиполнорационными гранулированными кормами, все мыши имели индивидуальные меткив течение жизни. Один раз в месяц мышей подвергали стандартной обработкепротивогрибковым спреем и антибактериальным препаратом Байтрил 5%, которыйдобавляли в воду для питья в количестве 100 мкл препарата на 100 мл воды в течениенедели.
Перед применением Tβ4 разводили в 75%-ном водном растворе глицерина (20 мкгTβ4/мл). Перед началом эксперимента (день 0) мышей обеих возрастных подгрупппропорционально разделили на опытную и контрольную группы путем созданиястратификационных выборок таким образом, чтобы во всех подгруппах средние значениявсех вышеперечисленных параметров достоверно не отличались.
Мышей опытной группы(n=13: 8 молодых и 5 старых) обрабатывали Tβ4 трехкратно (дни 0, 2 и 7 эксперимента).Раствор rTβ4 в количестве 200 мкл (4 мкг действующего вещества/мышь/обработку)наносили на участок кожи спины площадью 30х30мм2. Мышей контрольной группы(n=13: 9 молодых и 4 старых) обрабатывали по такой же схеме 75%-ным воднымраствором глицерина. Животных содержали групповым методом. Оценку проявлениясимптомов дерматита проводили независимо два экспериментатора двойным слепымметодом у всех мышей индивидуально; одновременно определяли вес мышей.47Регистрировали степень изъязвления кожи на спине по 10-балльной шкале (0 - нетповреждений; 1 - только перхоть; 2-4 балла - симптоматика, сходная с импетиго человека;5-7 баллов - симптоматика, сходная с проникающей эктимой; 8-10 баллов - симптоматика,сходная с синдромом ошпаренной кожи) и площадь пораженного участка спины, мм2(только алопеция, только изъязвление или оба симптома одновременно).
По мерепроведения эксперимента вычисляли относительное изменение параметров в опытнойгруппе по отношению к контрольной по формуле (Оi - Ki)/Ki·100%, где Оi – среднеезначение показателя в опытной группе; Кi – среднее значение аналогичного параметра вконтроле в то же самое время i. Терапевтический эффект Tβ4 оценивали по уменьшениюсимптоматики заболевания у пролеченных препаратом самок по сравнению с ихисходным состоянием (день 0) и по отношению к контролю.
Оценку проводили как длявозрастных подгрупп, так и для групп в целом во время проведения монотерапии Tβ4 (дни0-7-9 после начала эксперимента) и после применения дополнительной стандартнойпротивомикробной и противогрибковой терапии (дни 22-31-67, отдаленный эффекттерапии Tβ4). Статистическую обработку полученных данных проводили по t-критериюСтьюдента в программе Excel, используя непарный двухконцевой анализ данных.2.2. Результаты и обсуждение2.2.1.
Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получениярекомбинантного Tβ4 человека до пилотного производстваВ лаборатории биотехнологии ИБХ РАН была разработана технология получениярекомбинантного Тβ4 человека и на её основе создан лабораторный метод [36].Сконструирован штамм-продуцент E. coli ER2566/pER-TEVrsTB4, в котором прииндукции образовывался гибридный белок Trx-TEVrs-TB4 (22 кДа), состоящий изтиоредоксина, вспомогательных аффинных последовательностей, сайта расщепления TEV– протеиназой (ENLYFQ) и Тβ4 (Рис. 12).Рис.
12. Схема гибридного белка Trx-TEVrs-TB4.Биомассувыращивалинакачалочныхколбахиразрушалиспомощьюультразвукового дезинтегратора. Гибридный белок очищали с помощью анионообменнойхроматографии и расщепляли TEV – протеиназой. После расщепления гибридного белкаполученныйдезацетилтимозинβ4отделялиспомощьютангенциальнойультрафильтрации.
Очищенный дезацетилтимозин бета 4 ацетилировали уксусным48ангидридом с выходом 55% от теоретически возможного и очищали с помощью ОФВЭЖХ. Лабораторный метод позволял получить не более 20 мг целевого пептида с 1 лкультуральной среды. Для получения рекомбинантного Тβ4 человека в количествах,необходимых для проведения биологических испытаний, требовалось масштабировать иоптимизировать процесс получения целевого пептида.
Для решения данной задачинеобходимо было разработать технологию пилотного производства рекомбинантного Тβ4человека на основе созданного ранее лабораторного метода.2.2.1.1. Масштабирование стадии культивирования штамма-продуцента и стадииразрушения клеточной биомассыTβ4 является перспективным препаратом для лечения повреждений на коже,роговице глаза и восстановлении сердца после инфаркта миокарда. Этот пептиднеобходим в значительных количествах для доклинических исследований, поэтомунаиболее очевидным первым пунктом при масштабировании метода был отказ откультивирования штамма-продуцента на качалочных колбах из-за невысокого выходабиомассы. Переход на полупромышленный ферментёр объёмом 50 л увеличил среднийвыход влажной биомассы c 3 до 17 г с 1 л культуральной среды.
Экспрессия гибридногобелка при этом достигла 40%. Кроме того, отказались от ультразвуковой дезинтеграции,клеточную биомассу разрушали на высокоскоростном лабораторном гомогенизаторе. Приэтом степень разрушения клеток составила более 95%.2.2.1.2. Осаждение балластных белков из осветлённого клеточного лизатаДля оптимизации стадии анионообменной хроматографии было решено обогатитьосветлённый клеточный лизат по гибридному белку, поскольку примеси, содержащиеся восветлённом клеточном лизате, значительно снижали количество рабочих циклов иуменьшали динамическую ёмкость сорбента. В литературе описаны разные способыобогащения растворов белками [157, 158], наиболее распространённые и простые способы– изменение рН раствора [159] и высаливание [160].
Однако из научной литературыизвестно,чтотиоредоксин,входящийвсоставгибридногобелка,обладаеттермостабильными свойствами [161]. Поэтому для осаждения балластных белков былиспользован метод термической денатурации. При осаждении балластных белковтермической денатурацией супернатант постепенно нагревали, отбирая пробу на анализ синтервалом в 5оС (Рис. 13).49Рис. 13.
Осаждение балластных белков термической денатурацией: 1 — балластныебелки; 2 — гибридный белок.В диапазоне температур от 45 до 500С агрегировало почти 2/3 всех балластныхбелков. Потери гибридного белка при этом составили не более 10%. Дальнейшееповышение температуры приводило к экспоненциальному увеличению агрегированиягибридного белка. Таким образом, термическая денатурация оказалась наиболееоптимальным методом осаждения балластных белков.2.2.1.3. Оптимизация и масштабирование стадии анионообменной хроматографиигибридного белкаВ лабораторном методе для хроматографической очистки гибридного белкаиспользовали градиент концентрации 0 - 0,4 М NaCl. В результате температурнойобработки произошло обогащение клеточного лизата по гибридному белку, поэтомупоявилась возможность увеличить эффективную нагрузку на сорбент и перейти отградиентной к ступенчатой хроматографии гибридного белка (Рис.
14, 15). Необходимоотметить, что при масштабировании процесса элюции целевого белка ступенью буфераизменяются только объёмы сорбента и буферных растворов, что делает данный способэлюции легкомасштабируемым.50Рис. 14. Хроматографический профиль очистки гибридного белка.Рис. 15. Электрофоретический анализ фракций гибридного белка после разрушениябиомассы, тепловой обработки и анионообменной хроматографии (см. материалы иметоды): М — маркеры молекулярной массы; 1 — осветлённый клеточный лизат; 2 —супернатант после тепловой обработки; 3 — осадок после тепловой обработки; 4 —проскок после нанесения; 5 — уравновешивание колонны Буфером B; 6 — элюция сколонны Буфером С; 7 — регенерация колонны Буфером D.2.2.1.4.
Оптимизация и масштабирование стадии протеолитического расщеплениягибридного белкаРасщепление гибридного белка происходило по специфическому сайту (ENLYFQ)TEV – протеиназой. Для достижения высокого выхода реакции расщепления былосуществлён поиск оптимального соотношения фермент/субстрат при концентрации51восстанавливающего агента ДТТ 3 мМ, температуре 30°С и рН 8.3 (Рис. 16). Данныепараметры были найдены оптимальными ещё в лабораторном методе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
