Диссертация (1091859), страница 14
Текст из файла (страница 14)
ПЭГ-бутиральдегид располагается вобласти 25 кДа (Рис. 30, В, дорожка Р), т.е. на 5 кДа (масса пептида) ниже64электрофоретической подвижности ПЭГилированного Tβ4, что является косвеннымдоказательством того, что полученое вещество - моноПЭГилированный Tβ4. Наосновании приведённых выше результатов получен патент совместно с Есиповым Р.С.[174].2.2.2.4. Определение структуры полученных аналогов Tβ4Структуру полученных аналогов подтверждали пептидным картированием.
Вкачестве протеолитического фермента использовали Asp-N-протеиназу из Pseudomonasfragi [175]. Продукты протеолиза анализировали с помощью ОФ ВЭЖХ (Рис. 31). Излитературных источников известно, что данная протеиназа кроме Asp-N-активностиобладает еще и Glu-N-активностью [175], поэтому расщепление происходило как по Nконцу остатка аспарагиновой, так и по N-концу остатка глутаминовой кислот. Результатымасс-спектрометрического анализа представлены в табл. 5. В таблице также указана массаполученных коротких пептидных последовательностей, соответствующих фракциям нарисунке 31.Рис. 31. Хроматографический профиль продуктов протеолитического расщепления AspN-протеиназой субстратов: А – Tβ4, В − моногексаноилтимозин бета 4, С – моноконъюгатполисиаловой кислоты с Tβ4, D – моноконъюгат ПЭГ с Tβ4 (см. материалы и методы).65Таблица 5.
Результаты протеолитического расщепления Tβ4 и его аналогов по данныммасс-спектрометрического анализа.АВСDAc-SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES*НомерЭксперименталь Расчетное СоответствуетАминокислотнаяпика наное значение,значениепептидупоследовательностьРис. 31m/z[176], m/z1358,19358,42−4DKP2335,12335,385−7DMA3487,24487,521−4SDKP +acetate41304,741305,4913−23DKSKLKKTETQ51305,741306,4713−23DKSKLKKTET(Q)→E62243,132242,4124−43EKNPLPSKETIEQEKQAGES7664,36664,768−12EIEKF8981,47982,115−12DMAEIEKF1358,19358,42−4DKP2335,12335,385−7DMA31304,741305,4913−23DKSKLKKTETQ41305,741306,4713−23DKSKLKKTET(Q)→E5675,29675,752−7DKPDMA6377,31376,3721−23ETQ72243,132242,4124−43EKNPLPSKETIEQEKQAGES203,12203,11S + C6H11O8664,36664,768−12EIEKF9997,44998,115−12DMAEIEKF+Oxidation(M)10981,47982,115−12DMAEIEKF1358,19358,42−4DKP2335,12335,385−7DMA31304,741305,4913−23DKSKLKKTETQ41305,741306,4713−23DKSKLKKTET(Q)→E52243,132242,4124−43EKNPLPSKETIEQEKQAGES6664,36664,768−12EIEKF7981,47982,115−12DMAEIEKF11004,43100535−43EQEKQAGES2335,12335,385−7DMA31304,741305,4913−23DKSKLKKTETQ42243,132242,4124−43EKNPLPSKETIEQEKQAGES5664,36664,768−12EIEKF6981,47982,115−12DMAEIEKF*Однобуквенная последовательность Tβ4Из данных, приведенных на рисунке 31 и в таблице 5, можно сделать следующиевыводы о действии использованной протеиназы на указанные субстраты и об их составе.Tβ4.
При расщеплении данного соединения Asp-N-протеиназа гидролизовалапептидную связь между N-концевыми остатками серина и аспарагиновой кислоты толькона 10%; об этом свидетельствует наличие фракции, содержащей нерасщепленныйтетрапептид Ac-SDKP (пик 3) в реакционной смеси (Рис. 31, А). Трипептид DKP (пик 1)присутствует в реакционной смеси в малых количествах (Рис. 31, А).66Гексаноилтимозин бета 4.
Asp-N-протеиназа полностью гидролизовала пептиднуюсвязь между остатками модифицированного серина и аспарагиновой кислоты (Рис. 31, В).Методом масс-спектрометрического анализа был обнаружен ион, соответствующиймодифицированному серину (Рис. 32), находящийся во фракции, которая соответствуетпику 7 (Рис. 31, В), что является прямым доказательством модификации N-концевогосерина.Рис. 32.
Масс-спектр фракции 7 (см. Рис. 31, В) из смеси продуктов протеолизамоногексаноилтимозина бета 4СиалированныйTβ4.ПрианализегидролизатасиалированногоTβ4модифицированный серин обнаружен не был. Сиалированный серин имеет сильныйотрицательный заряд и не связывается с сорбентом. Стоит отметить, что профилигидролизата сиалированного Tβ4 и гидролизата исходного Tβ4 похожи (Рис. 31, С). Еслибы модифицированным оказался любой другой аминокислотный остаток в молекулепептида, то наблюдались бы значительные различия в хроматографических профиляхпротеолитического расщепления исходного Tβ4 и сиалированного продукта. Используяполученные данные, мы можем с высокой долей вероятности утверждать, чтомодификации подвергся N-концевой серин Tβ4.ПЭГилированный Tβ4. Хроматографический анализ гидролизата ПЭГилированногоTβ4 в совокупности с масс-спектрометрическим анализом полученных фракций показал,что модификации подвергся N-концевой тетрапептид SDKP (Рис.
31, D). Однакоидентифицировать тетрапептид было невозможно из-за того, что ПЭГилированныйфрагмент утратил точно фиксируемую массу. Необходимо отметить, что в тетрапептидеSDKP кроме аминогруппы N-концевого остатка серина содержится аминогруппа остаткализина,которыйкорректноготакже могПЭГилированияангионтензин-конвертирующимоказатьсяTβ4модифицированным. Длямодифицированныйферментом.Этотдоказательстватетрапептидферментявляетсяобработалидипептидил-карбоксипептидазой и способен расщеплять тетрапептид SDKP на два дипептида [177].Ангиотензин-конвертирующий фермент добавляли в смесь после протеолитическогорасщепления ПЭГилированного Tβ4 Asp-N-протеиназой.
В результате такого протеолизамодифицированный тетрапептид SDKP расщеплялся на модифицированный дипептид SD67и дипептид KP, последний был обнаружен в протеолитическом гидролизате методоммасс-спектрометрии (Рис. 33).Рис. 33. Масс-спектр продуктов протеолиза ПЭГилированного тетрапептидаSDKPТакимобразом,данныемасс-спектрометрическогоанализагидролизататетрапептида показали, что модификации подвергся дипептид SD, который содержитединственную свободную аминогруппу, по которой могло произойти ПЭГилирование –альфа-аминогруппу N-концевого серина.2.2.2.5. Определение стабильности полученных аналогов Tβ4Стабильность полученных аналогов Tβ4 и самого Tβ4 определяли в среде сывороткикрови кролика. Лиофилизованные образцы растворяли в физиологическом растворе ивводили в 50 мкл сыворотки крови.
Смесь инкубировали при 37ºС в течение 12 ч; пробыотбирали с интервалом в 1 ч. Для каждого пептида эксперимент повторяли 10 раз.Исследование кинетики деградации Tβ4 и его аналогов показало, что время, за котороесодержаниепептидауменьшилосьвдвое,дляTβ4составляет2ч,длямоногексаноилтимозина бета 4 − 8 ч, для моносиалированного Tβ4 − 6 ч и длямоноПЭГилированного Tβ4 − 10 ч. Таким образом, все аналоги Tβ4 показалипролонгированное время жизни в сыворотке крови кролика по сравнению с интанктноймолекулой.ВрезультатепроведённойработыбылиполученымоноконъюгатыПЭГ,полисиаловой и капроновой кислот с Tβ4.
Был разработан эффективный методрегиоселективной модификации пептида пропиональдегидным производным ПЭГ,бутиральдегидным производным полисиаловой кислоты и ангидридом гексановойкислоты. Было показано, что полученные аналоги являются производными Tβ4,модифицированногопоN-концевойальфа-аминогруппепептида.Исследованиестабильности полученных аналогов показало, что внесенные модификации значительноувеличили время жизни пептида в сыворотки крови.682.2.3.
Разработка интеин-опосредованного метода для производстварекомбинантного Tβ4 из ацетилированного гибирдного белка in vivo2.2.3.1. Создание рекомбинантных плазмид pER–Tb4GyrA–AcSer и pER – Tb4GyrA –AcAlaХимический способ модификации N-концевого серина Tβ4 ангидридом уксуснойкислоты не является единственным способом селективного ацетилирования пептида.Альтернативным подходом является ферментативный метод ацетилирования, в которомроль ацетилирующих ферментов играют ферменты из класса N–ацетилтрансфераз [37],использующие в качестве субстрата кофермент – ацетилкоэнзим А [178, 179].
Ввидувысокой стоимости кофермента промышленное получение Tβ4 ферментативнымацетилированием in vitro является нерентабельным. Наиболее перспективным с точкизрения производства представляется ацетилирование пептида in vivo, при котором мог быиспользоваться ацетилкоэнзим А самой клетки.В работе, для того чтобы создать экспрессионную систему, обеспечивающуюодновременныйсинтезTβ4иN-ацетилтрансферазы,мыклонировалигенысоответствующих полипептидов в полицистронную конструкцию под контролем сильногоТ7 промотора. За основу был взят вектор рTWIN1 (NEB, Англия), содержащийпоследовательности интеинов DnaB и GyrA, а также хитин–связывающих доменов.Амплифицированную последовательность Tβ4 клонировали по сайтам рестрикции NdeI иSapI, при этом из плазмиды удалялась последовательность, кодирующая интеин Ssp DnaB.Полученная при этом плазмида pER – Tb4GyrA кодировала гибридный белок Tb4GyrA,способный к автокаталитическому расщеплению в присутствии тиольных реагентов [180].ДалеевданныйвекторпосайтамрестрикцииPstIиBamHIклонировалиолигонуклеотидный дуплекс, содержащий измененную, по сравнению, с классическойпоследовательность Шайна–Дальгарно (AGGAGAATAACTAG).
Такая замена двухоснованийАТнаТАвстандартнойпоследовательностиШайна–Дальгарно(AGGAGAАATACTAG) необходима для ослабления связывания РНК с рибосомой настадии инициации трансляции и, в конечном итоге, для ослабления экспрессии второгогена в полицистроной конструкции [181, 182]. Указанная последовательность содержаласайты рестрикции NcoI и XhoI, которые были использованы для клонирования геновсериновой или аланиновой ацетилтрансфераз (Рис. 34).69Рис.34.СхематическоепоследовательностиДНКизображениеTβ4,интеинаэкспрессионныхиGyrAвекторов,аланиновойинесущихсериновойацетилтрансфераз.
TB4—последовательность Tβ4, GyrA—последовательность интеина,CBD—последовательностьхитин-связывающегодомена,RBS1—классическаяпоследовательность Шайна-Дальгарно (сайт связывания с рибосомой), RBS 2—модифицированная последовательность Шайна-Дальгарно (сайт связывания с рибосомой),AcSer—последовательностьсериновойN-ацетилтрансферазы,AcAla—последовательность аланиновой N-ацетилтрансферазы.2.2.3.2. Проверка экспрессии генов штаммов-продуцентов и расщепления гибридногобелкаСконструированные рекомбинантные плазмиды pER–Tb4GyrA–AcAla и pER–Tb4GyrA–AcSer были использованы для трансформации экспрессионных штаммов E. coliER2566 и E.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
