Диссертация (1091859), страница 16
Текст из файла (страница 16)
44. Хроматографический профиль продуктов протеолиза (см.материалы и методы).В результате протеолиза должно было получиться 4 пептидных фрагмента, однакоизвестно, что Asp-N протеиназа обладает ещё и Glu-N активностью, это объясняетналичие9пиков[175].Полученныепики76былиохарактеризованыметодомвремяпролётной масс-спектрометрии, результаты анализа представлены в Таблице 8,также в таблице приведена однобуквенная аминокислотная последовательность Tβ4.Таблица 8.
Результаты масс-спектрометрического анализа продуктов расщепления Tβ4.Ас – SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGESНомерНаблюдаемоеСоответствующийАминокислотнаяпиказначение, m/zфрагментпоследовательность1358,192-4DKP2445,221-4SDKP3335,125-7DMA4487,241-4SDKP + acetate51304,7413-23DKSKLKKTETQ61305,7413-23DKSKLKKTET(Q)→E72243,1324-43EKNPLPSKETIEQEKQAGES8664,368-12EIEKF9981,475-12DMAEIEKFАнализ результатов, представленных в таблице 8, показал, что ацетилированию invivo подвергся только N – концевой тетрапептид.
Поскольку этот тетрапептид помимоаминогруппы N-концевого остатка серина содержит в положении 3 остаток лизина (Lys3), необходимо было доказать, что не происходит присоединения ацетильной группы кбоковой группе этого остатка. Для этого использовали ангиотензин конвертирующийфермент, способный гидролизовать данный тетрапептид [177]. Результаты массспектрометрического анализа продуктов реакции гидролиза представлены на рисунке 45.Рис.
45. Масс-спектр продуктов гидролиза Ac-SDKP ангиотензин конвертирующимферментом.В результате хромато-масс-спектрометрического анализа продуктов реакциигидролиза тетрапептида были обнаружены 2 фрагмента, соответствующие по массамдипептидам Ac-SerAsp и LysPro. N-концевой дипептид (SerAsp) содержит единственнуюсвободную аминогруппу, по которой могло произойти ацетилирование – альфа77амиогруппу N-концевого серина. Таким образом, результаты анализа первичнойструктуры пептида подтвердили, что в полученном Tβ4 ацетилирование произошло черезальфа аминогруппу N-концевого серина Tβ4.2.2.4.
Эффективность рекомбинантного Tβ4 в спонтанной мышиной моделихронического дерматитаИсследовалиэффективностьдействияTβ4,полученноговлабораториибиотехнологии ИБХ РАН, в мышиной модели хронического дерматита совместно сМоисеевой Е.В., Бейраховой К.А., Семушиной С.Г., Ароновым Д.А. и Есиповым Р.С.[185]. Опыты проводили на девственных молодых и старых мышиных самках. Оценкуэффективности заживления ран после применения Tβ4 оценивали по уменьшениюплощади изъязвления.2.2.4.1. Влияние монотерапии препарата Tβ4 на проявление признаков дерматитаПосле однократного применения препарата Tβ4 (на день 7) наблюдалосьуменьшение степени изъязвления на 56% (р=0.047; Рис.
46, а) и площади пораженногоучастка спины на 35% (р=0.049; Рис. 46, б) относительно соответствующих показателей вконтрольной группе. После двукратного применения площадь пораженного участкаспины уменьшилась на 41% (день 9, p=0.047; Рис. 46, б). Обе возрастные подгруппыреагировали на обработку Tβ4 сходным образом. Однако после трехкратного примененияпрепарата относительно молодые самки демонстрировали более выраженную реакцию,вплоть до явной тенденции к ухудшению по степени изъязвления кожи (увеличениестепени изъязвления на 77% относительно контроля, день 9, р=0.16). Такойкраткосрочный эффект можно объяснить обострением хронического воспалительногопроцесса вследствие применения Tβ4 и/или отрицательным влиянием третьегоприменения препарата.
Во время проведения монотерапии препаратом масса мышейколебалась незначительно.78Рис. 46. Относительное изменение степени изъязвления (а) и площади пораженногоучастка (б) кожи спины самок мышей CBRB. 1-опытная подгруппа (возраст 29 недель), 2молодая подгруппа (возраст 15 недель), 3 – старая подгруппа (возраст 55 недель). *p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001 относительно соответствующего контроля (Оi Ki)/Ki·100%.2.2.4.2.
Отдаленные эффекты препарата Tβ4 на фоне дополнительнойпротивомикробной и противогрибковой терапииПосле последнего применения препарата Tβ4 всех мышей подвергли стандартнойпротивогрибковой и противомикробной обработке и вели наблюдение в течение двухмесяцев. Мыши, изначально пролеченные Tβ4, при отсутствии достоверных отличий повесу, демонстрировали улучшение в целом по пролеченной группе: уменьшение степениизъязвления на 55% и 51% (дни 22 и 67, р=0,09 и р=0,002, соответственно, Рис. 46 А),уменьшение площади пораженного участка спины на 28% (день 67, р=0,0008, Рис.
46 Б).При этом, улучшение в целом по группе объяснялось более выраженным ответом умолодых самок: уменьшение степени изъязвления на 83% и 100% (дни 22 и 67, р=0,013 ир=0,0001, соответственно (Рис. 46 А) и площади пораженного участка спины на 66% (день67, р=0,00005, Рис. 46 Б).Сравнение изучаемых показателей на день 67 по сравнению с днем 0 (Табл. 9) повозрастным подгруппам в опытной и контрольной группах показало, что, несмотря напроведение стандартной дополнительной терапии, состояние контрольных мышей, как иожидалось, достоверно ухудшилось: как у более молодых самок, так и в целом по группедостоверно увеличились степень изъязвления (р=0,0001 и р=0,0000, соответственно) иплощадь пораженного участка кожи спины (р=0,0014 и р=0,0049, соответственно). Тогдакак состояние мышей, изначально пролеченных Tβ4, в целом по группе было стабильным.Исключительно важно, что у всех мышей в подгруппе более молодых самок (возраст наконец наблюдения 25,5±0,3 недели) не наблюдалось изъязвления кожи и отсутствовалоувеличение площади поражения кожи спины за счет алопеции.
В то время, как старыесамки опытной группы (возраст на конец наблюдения 65,2±1,1 недель) демонстрировали79усиление симптоматики дерматита, но в значительно меньшей степени, чем контрольныесамки того же возраста (Табл. 9 и Рис. 46).Таблица 9. Сравнение конечных характеристик (день 67) подгрупп молодых и старыхсамок мышей по сравнению с исходными (день 0).ПоказательДеньКонтрольная группаОпытная группаМолодыеСтарыеВсяМолодыеСтарыеВся14,8±0,353,7±0,1группа14,5±0,356,4±1,1группа(n=9)(n=4)25,9±5,1(n=8)(n=5)29,5±5,3(n=13)Масса, г022,324,622,921,523,922,76722,925,123,523,126,024,200,92,31,31,42,01,5676,17,56,60,04,03,30133,3450,0223,8190,6340,0218,167469,4656,3522,8159,9450,0377,5Изъязвление,баллы(n=13)Площадь, мм2ДолгосрочныйпротивовоспалительныйэффектпрепаратаTβ4нафонедополнительной противомикробной и противогрибковой терапии можно объяснить: (1)системным иммуномодулирующим действием препарата в результате абсорбции черезповреждённые участки кожи и/или слизистые пищеварительного тракта, и/или (2)способностью Tβ4 восстанавливать повреждённые волосяные фолликулы за счётинициации активности стволовых клеток фолликулов.Таким образом, местная обработка кожи спины мышей рекомбинантным Tβ4 нетолько способствовала достоверному ослаблению симптомов хронического дерматита вобеих возрастных подгруппах, но и дала, на фоне дополнительной противомикробной ипротивогрибковой терапии, долгосрочный (в течение двух месяцев) терапевтическийэффект в оригинальной спонтанной мышиной модели дерматита человека, особенно усамок мышей более молодого возраста.803.
Выводы1. Проведена оптимизация и масштабирование лабораторной методики получениярекомбинантного человеческого Tβ4, врезультате которой увеличен выход Tβ4 с 20 до 80мг с 1 л культуральной жидкости. Разработан лабораторный регламент. На основепилотного производства получена опытная партия Tβ4 в количестве 2,5 г сфармацевтической чистотой для доклинических исследований.2. Получены моноконъюгаты ПЭГ, полисиаловой и гексановой кислот с Tβ4. Былиразработаныэффективныеметодырегиоселективноймодификациипептидапропиональдегидным производным ПЭГ, бутиральдегидным производным полисиаловойкислоты и ангидридом гексановой кислоты. Было показано, что полученные аналогиявляются производными Tβ4, модифицированного по N – концевой альфа аминогруппепептида. Также разработаны эффективные способы очистки полученных аналогов.Исследование стабильности полученных аналогов показало, что внесённые модификациизначительно увеличили время жизни пептида.3.
Разработан эффективный и прямой биотехнологический способ получениярекомбинантного Тβ4 человека на основе интеин-опосредованной экспрессионнойсистемы,прикоторомобеспечиваетсяполноеудалениеформилметионинаивысокоэффективное (не менее 90%) ацетилирование Тβ4 по N-концевому остатку серина всоставе белка предшественника in vivo.4.Биологическиеисследованияпродемонстрировалиэффективностьрекомбинантного Тβ4 человека в спонтанной мышиной модели хронического дерматита.Обработка кожидостоверномуспины мышейослаблениюрекомбинантным Тβ4симптомовхроническогочеловека способствоваладерматитаипривелакдолгосрочному (в течение 2 мес.) сохранению терапевтического эффекта в оригинальнойспонтанной мышиной модели дерматита человека.814.
Список литературы1) Hannappel, E. The thymosins. Prothymosin alpha, parathymosin, and beta-thymosins:structure and function / E. Hannappel, T. Huff // Vitamins and hormones.- 2003. - V. 66.- P.257–96.2). Goldstein, A. L. Thymosin β4: actin sequestering protein moonlights to repair injuredtissues / A. L. Goldstein, E.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
