Диссертация (1091859), страница 15
Текст из файла (страница 15)
coli С3030. Были созданы 4 штамма – продуцента на основе штамма E. coliER2566 и штамма E. coli С3030 (таблица 6).Таблица 6. Штаммы-продуценты.Штаммы E.colipER–Tb4GyrA–AcAlapER–Tb4GyrA–AcSerE. coli ER2566E. coli ER2566/pER–Tb4GyrA–AcSer E. coli ER2566/pER–Tb4GyrA–AcSerE. coli С3030E. coli С3030/pER–Tb4GyrA–AcSerE. coli С3030/pER–Tb4GyrA–AcSerДля проверки экспрессии генов штаммы–продуценты культивировали при 37°С вколбах с питательной средой, индуцировали при достижении оптической плотности OD600равной 1 и инкубировали 4 часа при 37°С. Содержание белка в биомассе анализировалиметодом электрофореза в денатурирующих условиях (Рис.
35).70Рис.35.Электрофоретическийанализклеточноголизата,осадкапослецентрифугирования клеточного лизата и осветлённого клеточного лизата штаммовпродуцентов E. coli ER2566/pER-Tb4GyrA-AcSer, E. coli ER2566/pER-Tb4GyrA-AcAla, E.coli C3030/pER-Tb4GyrA-AcSer и E. coli C3030/pER-Tb4GyrA-AcAla (см. материалы иметоды). M—Маркёр молекулярных масс; 1,4,7,10— клеточный лизат штаммовпродуцентов E. coli ER2566/pER-Tb4GyrA-AcSer, E.
coli ER2566/pER-Tb4GyrA-AcAla, E.coli C3030/pER-Tb4GyrA-AcSer, E. coli C3030/pER-Tb4GyrA-AcAla, соответственно;2,5,8,11— осадок после центрифугирования клеточного лизата штаммов-продуцентов E.coli ER2566/pER-Tb4GyrA-AcSer, E. coli ER2566/pER-Tb4GyrA-AcAla, E. coli C3030/pERTb4GyrA-AcSer,E.coliC3030/pER-Tb4GyrA-AcAla,соответственно;3,6,9,12—осветлённый клеточный лизат штаммов-продуцентов E. coli ER2566/pER-Tb4GyrA-AcSer,E. coli ER2566/pER-Tb4GyrA-AcAla, E. coli C3030/pER-Tb4GyrA-AcSer, E. coli C3030/pERTb4GyrA-AcAla, соответственно.Электрофоретический анализ показал, что при индукции во всех штаммах–продуцентах образовывался гибридный белок Tb4GyrА в растворимой форме ипараллельносгибриднымбелкомсинтезироваласьсериноваяилиаланиноваяацетилтрансферазы.
Спонтанное расщепление гибридного белка in vivo отсутствовало. Вовсех четырёх штаммах–продуцентах количество гибридного белка было практическиодинаково и составило около 23%, количество ацетилтрансферазы составило 8% отобщего количества белка клетки.Проверку расщепления гибридного белка осуществляли на хитиновом сорбенте встандартных условиях, указанных производителем плазмиды (NEB, England). Законтрольные были приняты точки 4 и 8 часов после внесения тиольного реагента (Рис.36).71Рис. 36. Электрофоретический анализ кинетики расщепления гибридного белка при 25◦C(см.
материалы и методы). Штамм-продуцент - E. coli C3030/pER-Tb4GyrA-AcSer. M маркёр молекулярных масс белков, 1 - осветлённый клеточный лизат, 2 - проба схитинового сорбента через 4 часа после уравновешивания колонны Буфером Q, 3 - проба схитинового сорбента через 8 часов от начала расщепления после элюции Буфером N.Расщепление происходило количественно и только в присутствии тиольногореагента.
Уже через 4 часа после внесения тиольного реагента около 60% гибридногобелка расщепилось, а через 8 часов – расщепился практически весь гибридный белок.2.2.3.3. Подбор условий ацетилирования in vivoТак как реакция расщепления гибридного белка проходила стандартно, всоответствии с протоколом описанным производителем плазмиды (NEB, England),ключевой стадией стало ацетилирование целевого пептида in vivo.Из полученных четырёх штаммов-продуцентов решено было выбрать один, вкотором наиболее эффективно происходило ацетелирование целевого пептида, с этойцелью был проведён ряд исследований. Все четыре штамма–продуцента инкубировалипри трёх переменных параметрах: время после индукции, питательная среда итемпература инкубирования.
Биомассу, полученную в результате инкубирования штаммапродуцента, обработали по описанной в экспериментальной части методике; гибридныйбелок, выделенный из биомассы, расщепляли на хитиновом сорбенте. Элюат с хитиновогосорбента после расщепления гибридного белка анализировали с помощью аналитическойОФ ВЭЖХ и методом масс-спектрометрии (Рис.
37, 38).72Рис. 37. Хроматографический профиль элюата после аффинной хроматографии. Штаммпродуцент - E. coli C3030/pER-Tb4GyrA-AcAla, температура инкубирования 37◦C, времяинкубирования после индукции 4 ч. (см.материалы и методы). 1—дезацетилтимозин бета4, 2— Tβ4, 3—конъюгат дитиотреитола с Tβ4, 4—конъюгат дитиотреитола сдезацетилтимозином бета 4, 5—конъюгат дитиотреитола с Tβ4.Предварительный ВЭЖХ анализ показал, что в элюате с хитинового сорбентасодержалиськонъюгатыдитиотреитоласацетилированнымпептидомидезацетилтимозином бета 4, которые являются промежуточными продуктами реакциирасщепления гибридного белка.Рис.
38. Масс-спектр элюата после аффинной хроматографии. 1—дезацетилтимозин бета4,2—Tβ4,3—конъюгатдитиотреитоласTβ4,4—конъюгатдитиотреитоласдезацетилтимозином бета 4, 5—конъюгат дитиотреитола с Tβ4.Пики на хроматограмме (Рис. 37), предшестующие пику дезацетилтимозина бета 4,соответствуют продуктам деградации Tβ4. При титровании элюата до рН 10 гидроксидомнатрияпроисходилгидролиз,входекоторогообразовывалисьдитиотреитол,ацетилированный пептид и дезацетилтимозин бета 4 (Рис. 39, 40).
Пик 4985,46 Да (Рис.38) – аддукт натрия.73Рис. 39. Хроматографический профиль элюата после гидролиза в щелочных условиях.Штамм-продуцент E. coli C3030/pER-Tb4GyrA-AcAla, температура инкубирования 37◦C,время инкубации после индукции 4 ч. (см.материалы и методы). Хроматографическийанализ был проведён на колонне YMC-PackOctyl 5 мкм с градиентом концентрации 80%ацетонитрила 19–25% в 0.1% ТФУ со скоростью 0.3 мл/мин. 1—дезацетилтимозин бета 4,2— Tβ4, 3— Tβ4SO.Рис. 40.
Масс-спектр элюата после гидролиза в щелочных условиях. 1—дезацетилтимозинбета 4, 2— Tβ4, 3— Tβ4SO.Содержание ацетилированной формы пептида относительно дезацетилтимозина бета4 являлось основной мерой эффективности штамма-продуцента по ацетилированиюцелевого пептида (Таблица 7). Представленные значения являются результатом трёхнезависимых экспериментов.Таблица 7. Зависимость содержания в смеси Tβ4 (%) от условий инкубирования.Штамм и питательнаяC3030C3030ER2566ER2566средаLBSOBLBSOBацетилтрансферазаВремя и37°C 4 чRim74±2RimJ68±3Rim66±3Rim Rim RimJ64±2 63±2 63±3RimL60±3RimJ59±230°C 8 ч59±155±256±253±1 52±349±247±444±1инкубирования 17°C 20 ч 50±3 46±3 45±3 42±2 40±2 36±3*Жирным шрифтом выделено максимальное накопление продукта37±230±2температураЗначимым результатом эксперимента оказалось то, что во всех штаммах–продуцентах в процессе посттрансляционной модификации происходило полное удалениеформилметионина с N–конца целевого пептида.
В результате многофакторногоэкспериментабылиподобраныусловия74(штаммE.ColiС3030,температураинкубирования 37ºС, питательная среда LB, время инкубирования 4 ч), при которыхсодержание в смеси Tβ4 достигало 74%. Необходимо отметить, что питательная средаSOB, рекомендуемая компанией–производителем для этого штамма, оказалась менееэффективна.Сравнение двух ацетилтрансфераз показало более высокую специфичностьсериновой ацетилтрансферазы (RimL).
При одних и тех же условиях количествонеацетилированного Tβ4 оказалось на 6% меньше, чем в случае аланиновойацетилтрансферазы.Следующей стадией определения оптимальных параметров инкубирования сталоисследование кинетики ацетилирования пептида при постоянной температуре 37ºС. Таккак наилучшие результаты показал штамм-продуцент С3030/pER–Tb4GyrA–AcSer,исследования кинетики ацетилирования проводили на нём. За контрольные были взятывременные точки 4, 8, 12, 16, 20, 24 и 28 ч. после индукции (Рис. 41).Рис. 41. Исследование кинетики ацетилирования штамма-продуцента E. coli С3030/pER–Tb4GyrA–AcSer при 37ºС.Через 20 часов после индукции доля Tβ4 выросла до 93% от общего количествадезацетилтимозина бета 4 и далее практически не увеличивалась (Рис.
42). Таким образом,наиболееоптимальнымвременем,закотороеацетилируетсяпрактическивесьпредшественник Tβ4 in vivo составило 20 часов с момента начала индукции.\Рис. 42. Хроматографический профиль элюата после аффинной хроматографии. Штамм–продуцент E. ColiС3030/pER–Tb4GyrA–AcSer , температура инкубирования 37 ºС, времяпосле индукции 20 ч.
(см. материалы и методы). 1 – дезацетилтимозин бета 4; 2 – Tβ4;3,4–низкомолекулярные примеси; 5– конъюгат дитиотреитола с Tβ4.75Далее рН раствора белка после 20 ч инкубирования титровали до 10 гидроксидомнатрия и анализировали пробу из раствора с помощью высокоэффективной жидкостнойхроматографии (Рис.
43).Рис. 43. Хроматографический профиль элюата после гидролиза в щелочных условиях. 1 –дезацетилтимозин бета 4, 2 – Tβ4 (см. материалы и методы).Главным преимуществом ацетилирования пептида in vivo с помощью специфическойацетилтрансферазы по сравнению с химическим ацетилированием стал не только высокийвыход Tβ4, равный 93%, но и отсутствие каких-либо побочных продуктов реакции [183]результаты получены совместно с Есиповым Р.С., Степаненко В.Н., МирошниковымА.И.]. На основании полученных результатов получен патент совместно с Есиповым Р.С.,Степаненко В.Н., Мирошниковым А.И.
[184].2.2.3.4. Протеолитический анализ последовательности Tβ4ВкачестведоказательствакорректногоацетилированияTβ4провелипротеолитическое расщепление пептида Asp-N протеиназой из Pseudomonas fragi [175].Полученную реакционную смесь анализировали с помощью ВЭЖХ, хроматографическийпрофиль представлен на рисунке 44.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
