Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1091859), страница 10

Файл №1091859 Диссертация (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов) 10 страницаДиссертация (1091859) страница 102018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 10)

Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С. Лигазной смесью трансформироваликомпетентные клетки и с помощью метода отбора клонов проводили скрининг тех клеток,которые содержат целевую ДНК (pER–TB4–Gyr).422.1.3.6. Создание рекомбинантной плазмиды pER –Tb4Gyr–RBSДНК, содержащую изменённую последовательность Шайна-Дальгарно, а такжесайты эндонуклеаз рестрикции получали из двух синтетических олигонуклеотидов RBS–1и RBS–2. Олигонуклеотиды смешивали в эквимольном количестве (по 600 пмоль),денатурировали при 90°С и подвергали отжигу при медленном понижении температурыдо 30°С. Плазмиду pER–TB4GyrA (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывали в 40 мкл буфера О (50мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой PstI (10ед.

акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl,0,1 мг/мл БСА) рестриктазой BamHI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Послеэлектрофореза в 15% агарозном геле векторный фрагмент вырезали из геля и переносилив 200 мкл буфера NT, растворяли при 50°С в течении 5-10 мин и наносили на колонкуNucleoSpin Extract II. Промывали буфером NT3 и элюировали 50 мкл буфера NE.Полученный синтетический фрагмент с изменённой последовательностью ШайнаДальгарно (SEQ ID NO 6) в количестве 2 пмоль прибавляли к раствору 1 мкг описанноговыше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2мМ рАТФ, 10 мМ дитиотреитол) и лигировали с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы втечение 12 ч при 10°С.

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки и спомощью метода отбора клонов проводили скрининг тех клеток, которые содержалицелевую ДНК (pER–TB4GyrA–RBS).2.1.3.7. Создание рекомбинантных плазмид pER–Tb4GyrA–AcAla и pER–Tb4GyrA–AcSerПлазмиду pER–TB4GyrA–RBS (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывали в 40 мкл буфера Y (33мМ трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл БСА)рестриктазой NcoI (10 ед.

акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой XhoI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при37°С. После электрофореза в 15% агарозном геле векторный фрагмент вырезали из геля ипереносили в 200 мкл буфера NT, растворяли при 50°С в течении 5-10 мин и наносили наколонку NucleoSpin Extract II. Промывали буфером NT 3 и элюировали 50 мкл буфера NE.Дляприготовлениягенасериновойацетилтрансферазыигенааланиновойацетилтрансферазы проводили амплификацию с помощью ПЦР, используя в качествематрицы геномную ДНК E.coli(0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров -синтетические олигонуклеотиды SerAcTr–seF, SerAcTr–seR и AlaAcTr–se–F, AlaAcTr–se–R (по 60 пмоль каждого).

ПЦР проводили в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе,43состоящем из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, вследующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Фрагменты длиной 564 и 609 п.о. после электрофореза в15% агарозном геле вырезали из геля и переносили в 200 мкл буфера NT, растворяли при50°С в течении 5-10 мин и наносили на колонку NucleoSpin Extract II.

Промывалибуфером NT 3 и элюировали 50 мкл буфера NE, затем расщепляли рестриктазами,которые использовали при приготовлении вектора. Полученные синтетические фрагментыс последовательностью сериновой ацетилтрансферазы и аланиновой ацетилтрансферазы вколичестве 2 пмоль прибавляли к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагментав 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ рАТФ, 10 мМдитиотреитол) и лигировали с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при10°С.

Лигазными смесями трансформировали компетентные клетки и с помощью методаотбора клонов проводили скрининг тех клеток, которые содержали целевые ДНК (pER–Tb4GyrA–AcAla и pER–Tb4GyrA–AcSer).2.1.3.8. Подбор условий ацетилирования in vivoПлазмидамиpER–Tb4GyrA–AcAlaиpER–Tb4GyrA–AcSerпоотдельноститрансформировали клетки E.

coli ER2566 и E. coli С3030. Полученные штаммыпродуценты культивировали в двух разных средах LB и SOB, содержащих ампициллин вконцентрации 100 мкг/мл при температуре 37°С. Индуцировали при достиженииоптической плотности OD600 равной 1. После индукции культуры инкубировали притемпературах 37°С и 4 ч, при 30°С и 8 ч, при 17°С и 20 ч.

Центрифугировали нацентрифуге Heraeus Cryofuge 6000i (Германия) 4000g, 30 мин. и 10°С. Культуральнуюжидкость декантировали, биомассу в количестве 100 мг ресуспензировали в 1 мл БуфераM и гомогенизировали с помощью гомогенизатора FastPrep 24 (MP Biomedicals, США).Центрифугировали на центрифуге Z383K (HERMLE, Германия) 19 000 g, 20 мин. и 10°С.Осветлённый клеточный лизат использовали на стадии аффинной хроматграфии.2.1.3.9. Оптимизация условий культивирования штамма-продуцента E.

coliС3030/pER–Tb4GyrA–AcSerПлазмидойpER–Tb4GyrA–AcSerтрансформироваликлеткиE.coliС3030.Полученный штамм-продуцент культивировали в среде LB, содержащей ампицилин вконцентрации 100 мкг/мл при температуре 37°С. Индуцировали при достиженииоптической плотности OD600 равной 1. После индукции культуры инкубировали притемпературе 37°С и времени 4, 8, 12, 16, 20, 24 и 28 ч. Центрифугировали на центрифуге44Heraeus Cryofuge 6000i(Германия) 4000g, 30 мин. и 10°С. Культуральную жидкостьдекантировали, биомассу в количестве 100 мг ресуспензировали в 1 мл Буфера M игомогенизировали с помощью гомогенизатора FastPrep 24 (MP Biomedicals, США).Центрифугировали на центрифуге Z383K (HERMLE, Германия) 19 000 g, 20 мин.

и 10°С.Осветлённый клеточный лизат использовали на стадии аффинной хроматграфии.2.1.3.10. Аффинная хроматография гибридного белкаОсветлённый клеточный лизат наносили на хитиновый сорбент (NEB, Англия)объёмом 1 мл, уравновешенный Буфером N.

Затем аффинный сорбент поочерёдноуравновесили сначала 2 объёмами буфера N, затем 2 объёмами Буфера P и 4 объёмамиБуфера Q при температуре 25°С. Через 8 ч целевой белок элюировали 2 объёмами БуфераN. рН элюата объемом 3 мл титровали до 10 раствором 5M NaOH. Раствор инкубировалипри 25°С в течение 24 часов. Далее значение рН элюата после стадии аффиннойхроматографии довели соляной кислотой до 3.2.1.3.11. ОФ ВЭЖХЭлюат наносили на колонку Диасорб 130 С16Т 16х250 мм. Разделяли в градиентеконцентрации 80%-ного ацетонитрила (0–30% за 50 мин) в 0,1% ТФУ со скоростью 3мл/мин.

Фракции, содержащие Tβ4 чистотой более 98%, объединяли и лиофилизовали.2.1.3.12. Аналитические методы контроляЭлектрофоретическое разделение ДНК проводили в 15 % агарозном геле с 0,006%бромистым этидием на системе 2301 Macrodrive–l (LKB) в Трис-ацетатном буфере.Электрофоретическое разделение белков производили на электрофоретической системеPowerPacHC (BIORAD, США) в 15% ПААГ по Лэммли [153]. Гели окрашивали растворомCoumassi R-250 (2,5 мг/мл). Анализ фракций, содержащих Tβ4, осуществляли с помощьюОФ ВЭЖХ на колонке Prosphere C18 300 A 5µ (Alltech, США).

Пептидные продуктыэлюировали в градиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (17–25% за 23 мин) в 0.1%TFA со скоростью 0.7 мл/мин при 25°С. Пептидные продукты реакции протеолизаэлюировали в градиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (2-50% за 20 мин) с 0,1%ТФУ на колонке Prosphere C18 300 A 5 µ (Alltech, США) со скоростью 0,7 мл/мин при25°С. Масс–спектрометрический анализ проводили на приборе 6224 TOF LC/MS (Agilenttechnologies, США).452.1.3.13.

Метод отбора клоновЛигазной смесью трансформировали компетентные клетки (штаммы ER 2566 илиС3030),трансформантывысевалинаагаризованнуюсредусампицилиномиинкубировали в течение 20 ч. при 37°С. Выросшие колонии с помощью петли встерильных условиях переносили в питательную среду LB с ампицилином объёмом 2 мл.Культивировали в течение 6 часов при 37°С и индуцировали добавлением 2 мкл 1000кратного раствора IPTG. Инкубировали в течение 4 часов при 37°С и центрифугировалина Z383K (HERMLE, Германия) 4500g в течение 8 мин. при 15°С. Осадок отделяли откультуральной среды и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе Sonics VCX 130(Stanford Equipment Co., США).

Клеточный лизат анализировали на наличие целевогогибридного белка с помощью электрофореза в ПААГ по Лэммли [153]. Клоны, в которыхподтвердилась экспрессия целевого гена, высевали в питательную среду LB сампицилином объёмом 5 мл. Культивировали при 37°С до достижения оптическойплотности OD600 равной 1,0 и центрифугировали на Z383K (HERMLE, Германия) 4500g втечение 8 мин при 15°С.

Из полученного осадка клеток выделяли целевую плазмиднуюДНК с помощью набора NucleoSpin Extract I.2.1.3.14. Методы трансформацииШтаммы ER2566 и С3030, хранящиеся в 20% глицерине при -70°С, переносили в лёди инкубировали 15 мин. Затем к 100 мкл смеси клеток в 20% глицерине добавляли от 1 до2 мкл плазмиды, либо от 3 до 4 мкл лигазной смеси и инкубировали в течение 15 мин. вольду. Клетки штамма ER2566 инкубировали в термостате ГНОМ (ДНК-технология,Россия) в течение 2 мин при 42°С и затем снова переносили в лёд на 2 мин.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
А знаете ли Вы, что из года в год задания практически не меняются? Математика, преподаваемая в учебных заведениях, никак не менялась минимум 30 лет. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6384
Авторов
на СтудИзбе
308
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее