Диссертация (1091859), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С. Лигазной смесью трансформироваликомпетентные клетки и с помощью метода отбора клонов проводили скрининг тех клеток,которые содержат целевую ДНК (pER–TB4–Gyr).422.1.3.6. Создание рекомбинантной плазмиды pER –Tb4Gyr–RBSДНК, содержащую изменённую последовательность Шайна-Дальгарно, а такжесайты эндонуклеаз рестрикции получали из двух синтетических олигонуклеотидов RBS–1и RBS–2. Олигонуклеотиды смешивали в эквимольном количестве (по 600 пмоль),денатурировали при 90°С и подвергали отжигу при медленном понижении температурыдо 30°С. Плазмиду pER–TB4GyrA (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывали в 40 мкл буфера О (50мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой PstI (10ед.
акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl,0,1 мг/мл БСА) рестриктазой BamHI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Послеэлектрофореза в 15% агарозном геле векторный фрагмент вырезали из геля и переносилив 200 мкл буфера NT, растворяли при 50°С в течении 5-10 мин и наносили на колонкуNucleoSpin Extract II. Промывали буфером NT3 и элюировали 50 мкл буфера NE.Полученный синтетический фрагмент с изменённой последовательностью ШайнаДальгарно (SEQ ID NO 6) в количестве 2 пмоль прибавляли к раствору 1 мкг описанноговыше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2мМ рАТФ, 10 мМ дитиотреитол) и лигировали с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы втечение 12 ч при 10°С.
Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки и спомощью метода отбора клонов проводили скрининг тех клеток, которые содержалицелевую ДНК (pER–TB4GyrA–RBS).2.1.3.7. Создание рекомбинантных плазмид pER–Tb4GyrA–AcAla и pER–Tb4GyrA–AcSerПлазмиду pER–TB4GyrA–RBS (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывали в 40 мкл буфера Y (33мМ трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл БСА)рестриктазой NcoI (10 ед.
акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой XhoI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при37°С. После электрофореза в 15% агарозном геле векторный фрагмент вырезали из геля ипереносили в 200 мкл буфера NT, растворяли при 50°С в течении 5-10 мин и наносили наколонку NucleoSpin Extract II. Промывали буфером NT 3 и элюировали 50 мкл буфера NE.Дляприготовлениягенасериновойацетилтрансферазыигенааланиновойацетилтрансферазы проводили амплификацию с помощью ПЦР, используя в качествематрицы геномную ДНК E.coli(0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров -синтетические олигонуклеотиды SerAcTr–seF, SerAcTr–seR и AlaAcTr–se–F, AlaAcTr–se–R (по 60 пмоль каждого).
ПЦР проводили в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе,43состоящем из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, вследующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Фрагменты длиной 564 и 609 п.о. после электрофореза в15% агарозном геле вырезали из геля и переносили в 200 мкл буфера NT, растворяли при50°С в течении 5-10 мин и наносили на колонку NucleoSpin Extract II.
Промывалибуфером NT 3 и элюировали 50 мкл буфера NE, затем расщепляли рестриктазами,которые использовали при приготовлении вектора. Полученные синтетические фрагментыс последовательностью сериновой ацетилтрансферазы и аланиновой ацетилтрансферазы вколичестве 2 пмоль прибавляли к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагментав 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ рАТФ, 10 мМдитиотреитол) и лигировали с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при10°С.
Лигазными смесями трансформировали компетентные клетки и с помощью методаотбора клонов проводили скрининг тех клеток, которые содержали целевые ДНК (pER–Tb4GyrA–AcAla и pER–Tb4GyrA–AcSer).2.1.3.8. Подбор условий ацетилирования in vivoПлазмидамиpER–Tb4GyrA–AcAlaиpER–Tb4GyrA–AcSerпоотдельноститрансформировали клетки E.
coli ER2566 и E. coli С3030. Полученные штаммыпродуценты культивировали в двух разных средах LB и SOB, содержащих ампициллин вконцентрации 100 мкг/мл при температуре 37°С. Индуцировали при достиженииоптической плотности OD600 равной 1. После индукции культуры инкубировали притемпературах 37°С и 4 ч, при 30°С и 8 ч, при 17°С и 20 ч.
Центрифугировали нацентрифуге Heraeus Cryofuge 6000i (Германия) 4000g, 30 мин. и 10°С. Культуральнуюжидкость декантировали, биомассу в количестве 100 мг ресуспензировали в 1 мл БуфераM и гомогенизировали с помощью гомогенизатора FastPrep 24 (MP Biomedicals, США).Центрифугировали на центрифуге Z383K (HERMLE, Германия) 19 000 g, 20 мин. и 10°С.Осветлённый клеточный лизат использовали на стадии аффинной хроматграфии.2.1.3.9. Оптимизация условий культивирования штамма-продуцента E.
coliС3030/pER–Tb4GyrA–AcSerПлазмидойpER–Tb4GyrA–AcSerтрансформироваликлеткиE.coliС3030.Полученный штамм-продуцент культивировали в среде LB, содержащей ампицилин вконцентрации 100 мкг/мл при температуре 37°С. Индуцировали при достиженииоптической плотности OD600 равной 1. После индукции культуры инкубировали притемпературе 37°С и времени 4, 8, 12, 16, 20, 24 и 28 ч. Центрифугировали на центрифуге44Heraeus Cryofuge 6000i(Германия) 4000g, 30 мин. и 10°С. Культуральную жидкостьдекантировали, биомассу в количестве 100 мг ресуспензировали в 1 мл Буфера M игомогенизировали с помощью гомогенизатора FastPrep 24 (MP Biomedicals, США).Центрифугировали на центрифуге Z383K (HERMLE, Германия) 19 000 g, 20 мин.
и 10°С.Осветлённый клеточный лизат использовали на стадии аффинной хроматграфии.2.1.3.10. Аффинная хроматография гибридного белкаОсветлённый клеточный лизат наносили на хитиновый сорбент (NEB, Англия)объёмом 1 мл, уравновешенный Буфером N.
Затем аффинный сорбент поочерёдноуравновесили сначала 2 объёмами буфера N, затем 2 объёмами Буфера P и 4 объёмамиБуфера Q при температуре 25°С. Через 8 ч целевой белок элюировали 2 объёмами БуфераN. рН элюата объемом 3 мл титровали до 10 раствором 5M NaOH. Раствор инкубировалипри 25°С в течение 24 часов. Далее значение рН элюата после стадии аффиннойхроматографии довели соляной кислотой до 3.2.1.3.11. ОФ ВЭЖХЭлюат наносили на колонку Диасорб 130 С16Т 16х250 мм. Разделяли в градиентеконцентрации 80%-ного ацетонитрила (0–30% за 50 мин) в 0,1% ТФУ со скоростью 3мл/мин.
Фракции, содержащие Tβ4 чистотой более 98%, объединяли и лиофилизовали.2.1.3.12. Аналитические методы контроляЭлектрофоретическое разделение ДНК проводили в 15 % агарозном геле с 0,006%бромистым этидием на системе 2301 Macrodrive–l (LKB) в Трис-ацетатном буфере.Электрофоретическое разделение белков производили на электрофоретической системеPowerPacHC (BIORAD, США) в 15% ПААГ по Лэммли [153]. Гели окрашивали растворомCoumassi R-250 (2,5 мг/мл). Анализ фракций, содержащих Tβ4, осуществляли с помощьюОФ ВЭЖХ на колонке Prosphere C18 300 A 5µ (Alltech, США).
Пептидные продуктыэлюировали в градиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (17–25% за 23 мин) в 0.1%TFA со скоростью 0.7 мл/мин при 25°С. Пептидные продукты реакции протеолизаэлюировали в градиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (2-50% за 20 мин) с 0,1%ТФУ на колонке Prosphere C18 300 A 5 µ (Alltech, США) со скоростью 0,7 мл/мин при25°С. Масс–спектрометрический анализ проводили на приборе 6224 TOF LC/MS (Agilenttechnologies, США).452.1.3.13.
Метод отбора клоновЛигазной смесью трансформировали компетентные клетки (штаммы ER 2566 илиС3030),трансформантывысевалинаагаризованнуюсредусампицилиномиинкубировали в течение 20 ч. при 37°С. Выросшие колонии с помощью петли встерильных условиях переносили в питательную среду LB с ампицилином объёмом 2 мл.Культивировали в течение 6 часов при 37°С и индуцировали добавлением 2 мкл 1000кратного раствора IPTG. Инкубировали в течение 4 часов при 37°С и центрифугировалина Z383K (HERMLE, Германия) 4500g в течение 8 мин. при 15°С. Осадок отделяли откультуральной среды и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе Sonics VCX 130(Stanford Equipment Co., США).
Клеточный лизат анализировали на наличие целевогогибридного белка с помощью электрофореза в ПААГ по Лэммли [153]. Клоны, в которыхподтвердилась экспрессия целевого гена, высевали в питательную среду LB сампицилином объёмом 5 мл. Культивировали при 37°С до достижения оптическойплотности OD600 равной 1,0 и центрифугировали на Z383K (HERMLE, Германия) 4500g втечение 8 мин при 15°С.
Из полученного осадка клеток выделяли целевую плазмиднуюДНК с помощью набора NucleoSpin Extract I.2.1.3.14. Методы трансформацииШтаммы ER2566 и С3030, хранящиеся в 20% глицерине при -70°С, переносили в лёди инкубировали 15 мин. Затем к 100 мкл смеси клеток в 20% глицерине добавляли от 1 до2 мкл плазмиды, либо от 3 до 4 мкл лигазной смеси и инкубировали в течение 15 мин. вольду. Клетки штамма ER2566 инкубировали в термостате ГНОМ (ДНК-технология,Россия) в течение 2 мин при 42°С и затем снова переносили в лёд на 2 мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
