Диссертация (1091859), страница 7
Текст из файла (страница 7)
На мышиных и крысиныхмоделях было показано, что LKKTETQ ускоряет заживление раны, активирует рост волоспутем активирующего воздействия на волосяные фоликулы [147]. Более того, отмечено,что этот гептапептид индуцирует дегрануляцию тучных клеток, участвующих валлергических процессах [148, 149].С-концевой тетрапептид в позиции 40-43 АО AGESвлияет на миграциюэмбриональных кардиомиоцитов и стабилизирует работу сердца в условиях ишемии [3].281.10.
Применение Tβ4 в клиникеБлагодарясвоиммногофункциональнымсвойствамТβ4обладаетвысокимтерапевтическим потенциалом для применения в качестве лекарственного препарата прилечении широкого спектра заболеваний (Рис. 11). Например, американская компанияRegenerx Biopharmaceuticals занимается разработкой разных форм лекарственныхпрепаратов на основе Тβ4. В 2009 г. компания завершила Фазу I клинических испытанийодного из таких препартов для ускорения заживления кожных ран, в которой Tβ4 былпризнан безопасным и легко переносимым.
Впоследствии были проведены исследованияэтого препарата на пациентах с III и IV стадиями пролежней [76] и трофических язв [150],и в обоих случаях наблюдалось ускоренное заживление ран. В настоящее времякомпанией RegeneRx ведутся поздние стадии клинических испытаний еще несколькихпрепаратов, направленных на лечение синдрома сухого глаза и нейротрофическойкератопатии. (Таблица 2).Рис. 11. Известные и потенциальные способы клинического применения Tβ4 [3].29Таблица 2.
Кандидаты в лекарства RegeneRx [151].Regenerx кандидаты в лекарстваRGN-259ГлазныекаплиRGN – 352инъекцияДоклиникаФаза 1Фаза 2Фаза 3Нейротрофическаякератопатия, США (Фаза 3)Регистрация и завершение 2015/16Умеренная или тяжёлаясухость глаз, США (Фаза 2b/3)Регистрация и завершение 2015/16Умеренная или тяжёлаясухость глаз, Корея (Фаза2b/3)НаменченоУмеренная или тяжёлаясухость глаз, Китай (Фаза 2b)НамеченоНейротрофическаякератопатия(благотворительноеиспользование)ЗавершеноТяжёлый синдром сухогоглаза (Фаза 2а)ЗавершеноУмеренный синдром сухогоглаза (Фаза 2)ЗавершеноВолонтёры (Фаза1)ЗавершеноПериферическая невропатияФаза 2 готоваТаким образом, Тβ4 – мультифункциональный пептид с плеотропной активностью,участвует в регуляции процессов клеточной миграции и регенерации структур разныхтканей организма, обладает противовоспалительными свойствами и способствуетклеточному выживанию.В совокупности это определеяет несомненную важностьполучения на основе Тβ4 биологически активных препаратов с перспективойиспользования их в практической медицине/клинической практике.2.
Собственные исследования2.1. Материалы и методы исследований2.1.1. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получениярекомбинантного Tβ4 человека до пилотного производства.2.1.1.1. МатериалыВ работе использовали Трис (трис(гидроксиметил)аминометан) (Panreac, Испания),хлорид натрия (Panreac, Испания), гидроксид натрия (Panreac, Испания), лимоннуюкислоту (Panreac, Испания), соляную кислоту (Panreac, Испания), ацетонитрил (Panreac,Испания), этанол (Panreac, Испания), изопропанол (Panreac, Испания), трифторуксуснуюкислоту (Sigma-Aldrich, США), ледяную уксусную кислоту (Panreac, Испания), ацетатаммония (Panreac, Испания), ацетат натрия (Panreac, Испания), мочевину отечественного30производства марки “ос.
ч.” и “х. ч.”; акриламид (Panreac, Испания), акриламид/бисакриламид 29/1 (Sigma aldrich, США), персульфат аммония (Merck), бромфеноловыйсиний (BioRad, США); N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин (TEMED) (BioRad, США),КумассиR250(BioRad,США),дитиотреитол(DTT)(Sigma-Aldrich,США),додецилсульфат натрия SDS (Sigma-Aldrich, США), Этилендиаминтетрауксусная кислота(ЭДТА) (Sigma-Aldrich, США), фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (Sigma-Aldrich,США), ампициллин (Sigma-Aldrich, США).Используемый штамм E. coli ER2566 (NEB, Ipswich, MA, США) [F-, λ-, fhuA2 (lon),ompT, lacZ::T7, genel gal sulA11 ∆ (mcrC-mrr)114::IS10 R (mcr-73::mini Tn10) 2 R(zgb210::Tn 10)1 (Tets) endA1 (dcm)].2.1.1.2.
Приготовление буферных растворовБуфер А (25 мМ Трис/HCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, pH 7,5), Буфер B (50 мМТрис/HCl; 1 мМ ЭДТА; pH 9,0), Буфер C (50 мМ Трис/HCl; pH 8,0; 0,4 M NaCl; рН 8,0),Буфер D (50 мМ Трис/HCl; pH 8,0; 1 M NaCl; рН 8,0), Буфер E (2 М мочевина; 50 мMТрис/HCl; pH 9,0), Буфер F (8 М мочевина; 50 мМ Трис/HCl; 2 мМ ЭДТА; pH 8,3), БуферG (50 мМ Трис/HCl, рН 8,3, 3 мМ DTT; рН 8,3), Раствор H (30 мМ CH3COOH; pH 3,0),Раствор J (30 мМ CH3COOH; pH 3,0; 1M NaCl), Буфер K (30 мМ CH3COOH/CH3COONa;pH 5,2), Буфер L (30 мМ CH3COOH/CH3COONa; pH 5,2, 1 М NaCl) были приготовленыпутём смешивания стоковых растворов 4 М NaCl, 1М Трис/HCl, 0,1М PMSF, 0,25МЭДТА, 8М мочевины с дистиллированной водой.
рН растворов доводили до указанныхзначений соляной кислотой и фильтровали через фильтр с порами диаметром 0,22 мкм.Все буферные растворы для ВЭЖХ были приготовлены из HQ-H2O, фильтрованы черезфильтр с диаметром пор 0,22мкм и дегазированы.2.1.1.3. Выращивание инокулята штамма ER2566/ pERTEVrsTB4 для засеваферментёраПлазмидой pERTEVrsTB4 трансформировали клетки E.
coli ER2566 и растили всреде LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, в течение ночи (16 ч) при37°С. Ночной культурой (1%) полученного штамма ER2566/pER-TEV засевали среду LB(ампициллин 100 мкг/мл) и культивировали в колбах 6 ч при температуре 28°С. Поокончании культивирования из колб отбирали пробы и измеряли оптическую плотность наспектрофотометре U – 2900 (Hitachi, Япония) при длине волны 600 нм, используя вкачестве контроля питательную среду. Оптическая плотность посевной культурысоставила (3,8±2,5) опт. ед. Общий объём инокулята составил 3 л.312.1.1.4. Культивирование штамма-продуцента ER2566/pERTEVrsTB4 в ферментёреФерментацию штамма-продуцента ER2566/pERTEVrsTB4 проводили в 250 лферментёре (Electrolux, Швеция), содержащем стерильную питательную среду LB.Культивирование штамма-продуцента проводили при температуре 37ºС, рН 7.0,концентрации растворенного кислорода (рО2) 55±5% от насыщения питательной среды идавлении 0,25±0,05 атм.
Скорость вращения мешалки устанавливали 250 оборотов вминуту, подачу стерильного воздуха в количестве 100 л в минуту, показания датчикарастворенного кислорода (рО2) – 100% и производили засев ферментера инокулятом.Продолжительность культивирования (12,0±0,5) ч. Через 7 – 7,5 часов от началакультивирования (при достижении оптической плотности культуральной жидкости,равной 28-30 оптическим единицам) проводили индукцию биосинтеза гибридного белка вклетках культуры посредством введения в ферментер 50 мл 10% водного раствораизопропил-β-D-тиогалактопиранозида. Через 4 - 4.5 часа после введения в аппаратиндуктора биосинтеза гибридного белка процесс останавливали.
Во время процессакультивирования осуществляли наблюдение за процессом, фиксируя ежечасно значенияпоказателей: время роста, температура культивирования, рО2, рН, оптическая плотностьпри длине волны 600 нм. Сбор биомассы клеток осуществляли на сепараторе (Avanti JE,США) при температуре 20ºС, скорости вращения ротора 165 с-1, скорости подачикультуральной жидкости на сепарирование 550 мл/мин. Было получено 850 г влажнойбиомассы.2.1.1.5.
Разрушение биомассыПолученную биомассу в количестве 500 г растворяли в Буфере А в соотношении1:10 и гомогенизировали на лабораторном гомогенизаторе APV–1000 (Германия) притемпературе5ºС.Степеньразрушенияклетокопределялимикроскопированием.Разрушенную клеточную суспензию центрифугировали на высокоскоростной центрифугеAvanti J-30I (Beckman Coulter, США) при 4500 об/мин, 5ºС в течение 1,5 часов.Полученный осветлённый клеточный лизат декантировали и определяли концентрациюбелка в растворе с помощью спектрофотометра U – 2900 (Hitachi, Япония) по методуБредфорда [152].
Было получено 5 л осветлённого клеточного лизата с концентрациейбелка 13 г/л.322.1.1.6. Подбор условий осаждения балластных белков из осветлённого клеточноголизатаПодбор условий осаждения балластных белков осуществляли в Буфере А приконцентрации белка 13 г/л. При температурной обработке раствора белка – буферныйраствор объёмом 10 мл нагревали на водяной бане WB-22 (Daihan scientific, ЮжнаяКорея), последовательно увеличивая температуру с 25 до 70ºС. Через каждые 5ºС отбиралипорцию раствора, которую центрифуировали, а из супернатанта и осадка отбирали пробыдля определения наличия гибридного белка.2.1.1.7.
Масштабирование процесса температурной обработки клеточного лизата5 л осветлённого клеточного лизата, полученные на стадии разрушения биомассы,подвергали тепловой обработке на водяной бане WB-22 (Daihan scientific, Южная Корея)при 50ºC в течение 15 мин. Центрифугировали на высокоскоростной центрифуге Avanti J30I (Beckman Coulter, США) при 4500 об/мин, 5ºС в течение 1,5 часов. Супернатантдекантировали и титровали рН до 9.0 с использованием 5 М раствора NaOH.Концентрацию белка в супернатанте измеряли с помощью спектрофотометра U – 2900(Hitachi, Япония) по методу Бредфорда [152].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
