Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1091859), страница 2

Файл №1091859 Диссертация (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов) 2 страницаДиссертация (1091859) страница 22018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Определение структуры полученных аналогов Tβ4 ........................................................................652.2.2.5. Определение стабильности полученных аналогов Tβ4 ...................................................................682.2.3. Разработка интеин-опосредованного метода для производства рекомбинантного Tβ4из ацетилированного гибирдного белка in vivo.............................................................................692.2.3.1.

Создание рекомбинантных плазмид pER–Tb4GyrA–AcSer и pER – Tb4GyrA – AcAla ...............692.2.3.2. Проверка экспрессии генов штаммов-продуцентов и расщепления гибридного белка ...............702.2.3.3. Подбор условий ацетилирования in vivo...........................................................................................722.2.3.4. Протеолитический анализ последовательности Tβ4 .......................................................................762.2.4.

Эффективность рекомбинантного Tβ4 в спонтанной мышиной модели хроническогодерматита .............................................................................................................................................782.2.4.1. Влияние монотерапии препарата Tβ4 на проявление признаков дерматита.................................782.2.4.2. Отдаленные эффекты препарата Tβ4 на фоне дополнительной противомикробной ипротивогрибковой терапии .............................................................................................................................7933. Выводы .....................................................................................................................................814.

Список литературы ..............................................................................................................824Список сокращенийACE –ангиотензин конвертирующий ферментCHX - хлоргексидинeEPCs - эмбриональные эндотелиальные клетки-предшественникиEPDCs – эпикардиальные клетки-предшественникиILK - интегрин связанная киназаMLC - лёгкая цепь миозинаMRTF-A –миокардин-связанный фактор транскрипции АMSCs - мезенхимальные стволовые клеткиSDS – додецилсульфат натрияTβ4 – тимозин бета 4Tβ4SO –сульфоксид тимозин бета 4TF5- термостабильная фракция 5АО – аминокислотные остаткиОФ ВЭЖХ – Обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматографияПААГ – Полиакриламидный гельПСК – Полисиаловая кислотаПЭГ – Полиэтиленгликоль5ВведениеАктуальность проблемы.

Открытие тимозинов в середине 1960-х годов произошлов ходе исследований роли тимуса в развитии иммунной системы позвоночных.Тимозинами были названы небольшие белки, первоначально выделенные из вилочковойжелезы, но как стало известно из дальнейших исследований, большинство из этих белковприсутствует во многих тканях организма [1]. Среди тимозинов пептид тимозин бета 4(Тβ4) считается наиболее распространённым, наиболее изученным и, вероятно, наиболеебиологически активным членом семьи бета тимозинов.

Благодаря тому, что молекула Тβ4является актин-связывающим пептидом, она регулирует полимеризацию актина, и, какследствие, регулирует клеточную миграцию, которая важна для процесса ангиогенеза,регенерации повреждённых тканей [2]. В разных клеточныхорганизмамоделях и на уровненеоднократно было показано, что молекула Тβ4 обладает уникальнымикардиопротекторными свойствами, принимает участие в стимулировании ангиогенеза вусловиях ишемии сердечной мышцы, блокирует в кардиомиоцитах проапоптотическиекаскады и, наоборот, активизирует внутриклеточные сигнальные пути, ответственные завыживаемость клеток в условиях стресса.

Регенерационный потенциал молекулы Тβ4активно исследуется и в других областях медицины. Активность этой молекулыпроявляется при лечения трофичесчких язв, ран и ожогов роговицы глаза человека [3].Благодаря противовоспалительным свойствам Тβ4 зарекомендовал себя как действующеевещество в препаратах для лечения признаков воспаления кожи – хроническихдерматитов. [4].Учитывая модулирующее влияние Tβ4 на клеточную дифференцировку, миграцию,регенерацию и другие процессы в организме, активно исследуются способы примененияпептида в составе лекарственных препаратов различной направленности.Исследование биораспределения Tβ4 по основным органам мыши выявило, чтоконцентрация Tβ4 в сыворотке крови мыши падает до исходного состояния уже через 40мин после введения пептида, а через 2 часа Tβ4 практически полностью выводится изорганизма [5], поэтому в настоящее время перспективным направлением являетсясовершенствование лекарственных форм на основе Tβ4 с устойчивой и пролонгированнойактивностью.С точки зрения технологии производства Тβ4 в настоящее время, существуютнесколько способов его получения: выделение из природных источников илисинтетический подход с использованием химических и микробиологических методовсинтеза.

Биотехнологический способ получения Тβ4 с использованием экспрессии6рекомбинантного гена в бактериальных клетках E. coli является достаточно эффективными экологически безопасным по сравнеию с химическим синтезом, однако существующиена сегодня биотехнологические методы получения целевого пептида громоздки и не всостоянии обеспечить получение нативного Тβ4.АктуальнойзадачейявляетсяполучениеаналоговТβ4сулучшеннымифармакокинетическими показателями.Цель исследования.

Разработать эффективную биотехнологию производстварекомбинантного тимозина бета 4 человека (рекомбинантный Тβ4 человека) и егоаналогов с улучшенными фармакокинетическими показателями.Задачи исследования.1. Разработатьэффективнуюбиотехнологиюпилотногопроизводстварекомбинантного Тβ4 человека.2. Изучить биологическую активность рекомбинантного Тβ4 человека.3. СинтезироватьаналогирекомбинантногоТβ4сулучшеннымифармакокинетическими показателями. Разработать эффективный способ их очистки.4. РазработатьбиотехнологическийметодполучениярекомбинантногоТβ4человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида.Научная новизна.1) Впервые разработана эффективная и легко масштабируемаятехнологияполучения рекомбинантного Тβ4 человека с использованием интеин-опосредованнойэкспресионнойсистемы,обеспечивающаяселективноевысокоэффективноеацетилирование рекомбинантного Тβ4 in vivo.2) Исследована биологическая активность рекомбинантного Тβ4 человека наспонтанной мышиной модели хронического дерматита и показана его эффективность влечении хронических заболеваний кожи.3) Синтезированы три аналога рекомбинантного Тβ4 человека с улучшеннымифармакокинетическими показателями.

Разработан эффективный способ очистки аналоговрекомбинантного Тβ4 человека с использованием методов ОФ ВЭЖХ.Практическаязначимостьработы.Сиспользованиемразработаннойбиотехнологии пилотного производства рекомбинантного Тβ4 человека была наработанаопытная партия 2,5 г рекомбинантного Тβ4 человека для медико-биологическихиспытаний. Разработанная технология ацетилирования пептида in vivo обеспечилаэффективный и экономичный способ получения рекомбинантного Тβ4 человека.7Основные положения, выносимые на защиту.1. Разработанаэффективнаябиотехнологияпилотногопроизводстварекомбинантного Тβ4 человека.2.

Биологическиеисследованияпродемонстрировалиэффективностьрекомбинантного Тβ4 человека в спонтанной мышиной модели хронического дерматита.3. ПроведёнсинтезаналоговрекомбинантногоТβ4сулучшеннымифармакокинетическими показателями. Разработаны эффективные способы их очистки.4. РазработанбиотехнологическийметодполучениярекомбинантногоТβ4человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида.Апробацияработы.РезультатыисследованийбылидоложенынаXXVМеждународной зимней молодёжной школе «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии» (Россия, Москва, 2013), VI российскомсимпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Уфа, 2013), Международной научнойконференциипобиоорганическойхимии,биотехнологииибионанотехнологии,посвящённой 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Россия, Москва,2014).Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4статьи в реферируемых научных журналах, 3 тезисов докладов на российских имеждународных конференциях, получено 4 патента.Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения; литературногообзора; материалов и методов исследований; описания собственных исследований;результатов исследований; обсуждения полученных результатов; выводов; спискалитературы. Работа изложена на 100 страницах, включая 46 рисунков, 9 таблиц. Списокцитируемой литературы содержит 185 источника.81. Литературный обзор1.1. Тимозины и их свойства. Тимозин бета 4В 1966 г Goldstein с коллегами выделили из тимусовой железы телёнкатермостабильную фракцию 5 (TF5). Эта фракция состояла из 30 полипептидов смолекулярной массой от 1 до 15 кДа [6] и обладала способностью стимулироватьсозревание Т- клеток, модулирулируя Т-клеточный ответ [7], что впоследствие позволилоприменять TF5 при лечении детей с опасными для жизни болезнями иммунодифицита.Входящие в TF5 пептиды образуют несколько видов тимозинов, которые принадлежат ксемейству модификаторов биологических реакций (BRMs), регулирующих иммунныереакции и участвующих в процессах регенерации тканей после повреждения.

Среди нихотдельно можно выделить тимозин альфа 1, обладающий иммуномодулирующимисвойствами. Этот пептид применяется при лечении хронического вируса гепатита С и впротивораковой терапии, в частности, при лечении гепатоцеллюлярной карциномы [8].Пептиды тимозин бета 4 (Тβ4) , а также тимозин бета 10 и тимозин бета 15 , за счет актинсвязывающей способности играют важную роль в организации цитоскелета [2,9-11], атакже регулируют иммунные реакции и участвуют в регенерации тканей послеповреждений.Тβ4 считается наиболее распространённым, наиболее изученным и, вероятно,наиболее биологически активным членом семейства бета тимозинов. Он присутствуетпрактически во всех клетках, за исключением кровяных телец (эритроцитов), а такжеприсутствует в жидкостях тела, таких как: слюна, кровь, плазма, жидкость раны, слёзы[12].

Этот короткий полипептид локализован как в цитоплазме, так и в ядре клетки.Тβ4былохарактеризованкакактин-связывающийбелок,стимулирующийклеточную миграцию [13,14]. Недавно было обнаружено, что связывание Тβ4 смономером актина (G-актином) регулирует процессы синтеза металлопротеиназы иполимеризации актина в микрофиламенты (F-актин). Под действием градиентаконцентрации Тβ4, металлопротеиназа уменьшает своё взаимодействие с G- актином, чтоделает G-актин доступным для филаментной сборки и, в свою очередь, способствуетувеличению подвижности клетки [15]. Благодаря тому, что Тβ4 стимулирует миграциюклеток, ангиогенез во многих тканях организма [16,17].

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
А знаете ли Вы, что из года в год задания практически не меняются? Математика, преподаваемая в учебных заведениях, никак не менялась минимум 30 лет. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6367
Авторов
на СтудИзбе
310
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее