Диссертация (1091859), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Определение структуры полученных аналогов Tβ4 ........................................................................652.2.2.5. Определение стабильности полученных аналогов Tβ4 ...................................................................682.2.3. Разработка интеин-опосредованного метода для производства рекомбинантного Tβ4из ацетилированного гибирдного белка in vivo.............................................................................692.2.3.1.
Создание рекомбинантных плазмид pER–Tb4GyrA–AcSer и pER – Tb4GyrA – AcAla ...............692.2.3.2. Проверка экспрессии генов штаммов-продуцентов и расщепления гибридного белка ...............702.2.3.3. Подбор условий ацетилирования in vivo...........................................................................................722.2.3.4. Протеолитический анализ последовательности Tβ4 .......................................................................762.2.4.
Эффективность рекомбинантного Tβ4 в спонтанной мышиной модели хроническогодерматита .............................................................................................................................................782.2.4.1. Влияние монотерапии препарата Tβ4 на проявление признаков дерматита.................................782.2.4.2. Отдаленные эффекты препарата Tβ4 на фоне дополнительной противомикробной ипротивогрибковой терапии .............................................................................................................................7933. Выводы .....................................................................................................................................814.
Список литературы ..............................................................................................................824Список сокращенийACE –ангиотензин конвертирующий ферментCHX - хлоргексидинeEPCs - эмбриональные эндотелиальные клетки-предшественникиEPDCs – эпикардиальные клетки-предшественникиILK - интегрин связанная киназаMLC - лёгкая цепь миозинаMRTF-A –миокардин-связанный фактор транскрипции АMSCs - мезенхимальные стволовые клеткиSDS – додецилсульфат натрияTβ4 – тимозин бета 4Tβ4SO –сульфоксид тимозин бета 4TF5- термостабильная фракция 5АО – аминокислотные остаткиОФ ВЭЖХ – Обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматографияПААГ – Полиакриламидный гельПСК – Полисиаловая кислотаПЭГ – Полиэтиленгликоль5ВведениеАктуальность проблемы.
Открытие тимозинов в середине 1960-х годов произошлов ходе исследований роли тимуса в развитии иммунной системы позвоночных.Тимозинами были названы небольшие белки, первоначально выделенные из вилочковойжелезы, но как стало известно из дальнейших исследований, большинство из этих белковприсутствует во многих тканях организма [1]. Среди тимозинов пептид тимозин бета 4(Тβ4) считается наиболее распространённым, наиболее изученным и, вероятно, наиболеебиологически активным членом семьи бета тимозинов.
Благодаря тому, что молекула Тβ4является актин-связывающим пептидом, она регулирует полимеризацию актина, и, какследствие, регулирует клеточную миграцию, которая важна для процесса ангиогенеза,регенерации повреждённых тканей [2]. В разных клеточныхорганизмамоделях и на уровненеоднократно было показано, что молекула Тβ4 обладает уникальнымикардиопротекторными свойствами, принимает участие в стимулировании ангиогенеза вусловиях ишемии сердечной мышцы, блокирует в кардиомиоцитах проапоптотическиекаскады и, наоборот, активизирует внутриклеточные сигнальные пути, ответственные завыживаемость клеток в условиях стресса.
Регенерационный потенциал молекулы Тβ4активно исследуется и в других областях медицины. Активность этой молекулыпроявляется при лечения трофичесчких язв, ран и ожогов роговицы глаза человека [3].Благодаря противовоспалительным свойствам Тβ4 зарекомендовал себя как действующеевещество в препаратах для лечения признаков воспаления кожи – хроническихдерматитов. [4].Учитывая модулирующее влияние Tβ4 на клеточную дифференцировку, миграцию,регенерацию и другие процессы в организме, активно исследуются способы примененияпептида в составе лекарственных препаратов различной направленности.Исследование биораспределения Tβ4 по основным органам мыши выявило, чтоконцентрация Tβ4 в сыворотке крови мыши падает до исходного состояния уже через 40мин после введения пептида, а через 2 часа Tβ4 практически полностью выводится изорганизма [5], поэтому в настоящее время перспективным направлением являетсясовершенствование лекарственных форм на основе Tβ4 с устойчивой и пролонгированнойактивностью.С точки зрения технологии производства Тβ4 в настоящее время, существуютнесколько способов его получения: выделение из природных источников илисинтетический подход с использованием химических и микробиологических методовсинтеза.
Биотехнологический способ получения Тβ4 с использованием экспрессии6рекомбинантного гена в бактериальных клетках E. coli является достаточно эффективными экологически безопасным по сравнеию с химическим синтезом, однако существующиена сегодня биотехнологические методы получения целевого пептида громоздки и не всостоянии обеспечить получение нативного Тβ4.АктуальнойзадачейявляетсяполучениеаналоговТβ4сулучшеннымифармакокинетическими показателями.Цель исследования.
Разработать эффективную биотехнологию производстварекомбинантного тимозина бета 4 человека (рекомбинантный Тβ4 человека) и егоаналогов с улучшенными фармакокинетическими показателями.Задачи исследования.1. Разработатьэффективнуюбиотехнологиюпилотногопроизводстварекомбинантного Тβ4 человека.2. Изучить биологическую активность рекомбинантного Тβ4 человека.3. СинтезироватьаналогирекомбинантногоТβ4сулучшеннымифармакокинетическими показателями. Разработать эффективный способ их очистки.4. РазработатьбиотехнологическийметодполучениярекомбинантногоТβ4человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида.Научная новизна.1) Впервые разработана эффективная и легко масштабируемаятехнологияполучения рекомбинантного Тβ4 человека с использованием интеин-опосредованнойэкспресионнойсистемы,обеспечивающаяселективноевысокоэффективноеацетилирование рекомбинантного Тβ4 in vivo.2) Исследована биологическая активность рекомбинантного Тβ4 человека наспонтанной мышиной модели хронического дерматита и показана его эффективность влечении хронических заболеваний кожи.3) Синтезированы три аналога рекомбинантного Тβ4 человека с улучшеннымифармакокинетическими показателями.
Разработан эффективный способ очистки аналоговрекомбинантного Тβ4 человека с использованием методов ОФ ВЭЖХ.Практическаязначимостьработы.Сиспользованиемразработаннойбиотехнологии пилотного производства рекомбинантного Тβ4 человека была наработанаопытная партия 2,5 г рекомбинантного Тβ4 человека для медико-биологическихиспытаний. Разработанная технология ацетилирования пептида in vivo обеспечилаэффективный и экономичный способ получения рекомбинантного Тβ4 человека.7Основные положения, выносимые на защиту.1. Разработанаэффективнаябиотехнологияпилотногопроизводстварекомбинантного Тβ4 человека.2.
Биологическиеисследованияпродемонстрировалиэффективностьрекомбинантного Тβ4 человека в спонтанной мышиной модели хронического дерматита.3. ПроведёнсинтезаналоговрекомбинантногоТβ4сулучшеннымифармакокинетическими показателями. Разработаны эффективные способы их очистки.4. РазработанбиотехнологическийметодполучениярекомбинантногоТβ4человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида.Апробацияработы.РезультатыисследованийбылидоложенынаXXVМеждународной зимней молодёжной школе «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии» (Россия, Москва, 2013), VI российскомсимпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Уфа, 2013), Международной научнойконференциипобиоорганическойхимии,биотехнологииибионанотехнологии,посвящённой 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Россия, Москва,2014).Публикации.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4статьи в реферируемых научных журналах, 3 тезисов докладов на российских имеждународных конференциях, получено 4 патента.Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения; литературногообзора; материалов и методов исследований; описания собственных исследований;результатов исследований; обсуждения полученных результатов; выводов; спискалитературы. Работа изложена на 100 страницах, включая 46 рисунков, 9 таблиц. Списокцитируемой литературы содержит 185 источника.81. Литературный обзор1.1. Тимозины и их свойства. Тимозин бета 4В 1966 г Goldstein с коллегами выделили из тимусовой железы телёнкатермостабильную фракцию 5 (TF5). Эта фракция состояла из 30 полипептидов смолекулярной массой от 1 до 15 кДа [6] и обладала способностью стимулироватьсозревание Т- клеток, модулирулируя Т-клеточный ответ [7], что впоследствие позволилоприменять TF5 при лечении детей с опасными для жизни болезнями иммунодифицита.Входящие в TF5 пептиды образуют несколько видов тимозинов, которые принадлежат ксемейству модификаторов биологических реакций (BRMs), регулирующих иммунныереакции и участвующих в процессах регенерации тканей после повреждения.
Среди нихотдельно можно выделить тимозин альфа 1, обладающий иммуномодулирующимисвойствами. Этот пептид применяется при лечении хронического вируса гепатита С и впротивораковой терапии, в частности, при лечении гепатоцеллюлярной карциномы [8].Пептиды тимозин бета 4 (Тβ4) , а также тимозин бета 10 и тимозин бета 15 , за счет актинсвязывающей способности играют важную роль в организации цитоскелета [2,9-11], атакже регулируют иммунные реакции и участвуют в регенерации тканей послеповреждений.Тβ4 считается наиболее распространённым, наиболее изученным и, вероятно,наиболее биологически активным членом семейства бета тимозинов. Он присутствуетпрактически во всех клетках, за исключением кровяных телец (эритроцитов), а такжеприсутствует в жидкостях тела, таких как: слюна, кровь, плазма, жидкость раны, слёзы[12].
Этот короткий полипептид локализован как в цитоплазме, так и в ядре клетки.Тβ4былохарактеризованкакактин-связывающийбелок,стимулирующийклеточную миграцию [13,14]. Недавно было обнаружено, что связывание Тβ4 смономером актина (G-актином) регулирует процессы синтеза металлопротеиназы иполимеризации актина в микрофиламенты (F-актин). Под действием градиентаконцентрации Тβ4, металлопротеиназа уменьшает своё взаимодействие с G- актином, чтоделает G-актин доступным для филаментной сборки и, в свою очередь, способствуетувеличению подвижности клетки [15]. Благодаря тому, что Тβ4 стимулирует миграциюклеток, ангиогенез во многих тканях организма [16,17].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
