Диссертация (1091859), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Реакцию проводили при 25°С и тщательном перемешивании в течение 5ч. Образование конъюгата ПЭГ с Tβ4 контролировали с использованием методов ОФВЭЖХ и SDS-электрофореза в 13%-ном ПААГ по Лэммли [153].2.1.2.9. Масштабирование реакции ПЭГилирования дезацетилтимозина бета 4К 10 мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, рН 4,0), содержащегорекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1мг/мл, добавляли 80 мгцианборгидрида натрия и 80 мг пропиональдегидного производного ПЭГ (мольноесоотношение 1:4). Реакционную смесь тщательно перемешивали и инкубировали втечение 3 ч при 25°С.
Контроль образования моноПЭГилированного Tβ4 проводили сиспользованием метода ОФ ВЭЖХ.2.1.2.10. Очистка моноПЭГилированного Tβ4Реакционную смесь объемом 10 мл разбавляли в 10 раз дистиллированной водой инаносили на колонну «Диасорб» 130 С16Т, 8 мкм, 15 × 250мм. Разделение проводили вградиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (30−70% за 60 мин) в 0,1% ТФУ соскоростью 3,5 мл/мин. Фракции, содержащие более 98% моноПЭГилированного Tβ4,объединяли и лиофилизовали.2.1.2.11. Определение структуры модифицированного Tβ4Лиофилизованные производные Tβ4 в количестве 200 мкг (массу рассчитывали попептиду) растворяли в 50 мкл буфера (50 мМ Трис/HCl, рН 8,0), затем добавляли 5 мкл0,067 мг/мл раствора Asp-N-протеиназы (0,335 мкг) и инкубировали в течение 3 ч при37°С.
Протеолитическую смесь анализировали методом хромато-масс-спектрометрии.Расщепление ангиотензин-конвертирующим ферментом проводили сразу после обработкипептида Asp-N-протеиназой. К 55 мкл гидролизата добавляли 4 мкл 4 М NaCl до конечнойконцентрации 300 мМ и 5 мкл 0,03 мг/мл раствора ангиотензин-конвертирующего38фермента. Смесь инкубировали в течение 3 ч при 37°С и анализировали методом хроматомасс-спектрометрии.2.1.2.12. Тестирование стабильности аналогов Tβ4 и химически синтезированногоTβ4 с использованием сыворотки кровиСтабильность пептида определяли как время, за которое в сыворотке кровиоставалось 50% пептида от его исходного количества (T1/2). Количество оставшегосяпептида определяли как отношение площади хроматографического пика исследуемогообразца в момент времени t к площади хроматографического пика исследуемого образца вначальный момент времени (St/S0, где St −площадь пика исследуемого образца в моментвремени t, S0 – площадь пика исходного количества исследуемого образца).
Сывороткувыделяли из крови кролика в соответствии с рекомендациями, описанными в статье [154],расфасовывали по 50 мкл и замораживали при −70°С. Расфасованную сыворотку кровииспользовали однократно. Тестируемые образцы в количестве 50 мкг (по пептиду)растворяли в стерильном физиологическом растворе и вводили в концентрации 10 мг/мл в50 мкл сыворотки крови. Инкубировали течение 1−12 ч при 37°С. Смесь анализировалиметодом хромато-масс-спектрометрии.2.1.2.13. Аналитические методы контроляРазделение белков производили на электрофоретической системе PowerPac HC(BioRad, США) в 15%- и 13%-ном ПААГ по Лэммли [153]. Гели окрашивали растворомCoumassi R-250 (2,5 мг/мл) для проявления белка и 5%-ным раствором иодида бария дляокрашивания ПЭГ [155]. Анализ фракций, содержащих производные Тβ4, осуществляли спомощью ОФ ВЭЖХ на колонке Prosphere C18 300 A 5 µ (Alltech, США).
Пептидныепродукты реакции ПЭГилирования и ацилирования Tβ4 элюировали в градиентеконцентрации80%-ногоацетонитрила(30−70%,19мини15−50%,13мин,соответственно) в 0,1%-ной ТФУ со скоростью элюции 0,7 мл/мин. Пептидные продуктысиалирования элюировали в градиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (15−50%, 13мин) в 1% NH4OAc со скоростью 0,7 мл/мин при 25°С. Пептидные продукты реакцийпротеолиза элюировали в градиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (2-50% за20мин) с 0,1%ТФУ на колонке Prosphere C18 300 A 5 µ (Alltech, США) при 25°С.Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на приборе 6224 TOF LC/MS(Agilent Тechnologies, США).392.1.3.
Разработка интеин-опосредованного метода получения рекомбинантного Tβ4из ацетилированного гибридного белка in vivo2.1.3.1. МатериалыВ работе использовали Трис (трис(гидроксиметил)аминометан) (Panreac, Испания),хлорид натрия (Panreac, Испания), хлорид кальция (Panreac, Испания), фосфат натрия(Panreac, Испания), бромистый этидий (Sigma-aldrich, США), фосфорную кислоту(Panreac, Испания), гидроксид натрия (Panreac, Испания), соляную кислоту (Panreac,Испания), уксусную кислоту (Panreac, Испания), уксусный ангидрид (Sigma-aldrich,США), этанол (Panreac, Испания), ацетонитрил (Panreac, Испания), глицерин (Panreac,Испания), мочевину отечественного производства марки “ос.
ч.” и “х. ч.”; акриламид(Panreac, Испания), N,N' – метиленбисакриламид, персульфат аммония (Merck), АТР(Sigma-aldrich, США), dNTP (Sigma-aldrich, США), агарозу (Sigma-aldrich, США), агар(Panreac, Испания), дрожжевой экстракт (Panreac, Испания), бактотриптон (Panreac,Испания), бактоагар (Panreac, Испания), бромфеноловый синий (BioRad, США); N,N,N',N'тетраметилэтилендиамин (TEMED) (BioRad, США), Кумасси R 250 (BioRad, США),дитиотреитол (DTT) (Sigma-Aldrich, США), додецилсульфат натрия SDS (Sigma-Aldrich,США),Этилендиаминтетрауксуснаякислота(ЭДТА)(Sigma-Aldrich,фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (Sigma-Aldrich, США), глицинСША),(Sigma-aldrich,США), бромистый этидий (Sigma-aldrich, США), Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид(IPTG) (Sigma-aldrich, США).
Используемые штаммы E. coli ER2566 (NEB, Ipswich, MA,U.S.A.) [F–, λ–, fhuA2 (lon), ompT, lacZ::T7, genel gal sulA11 ∆ (mcrC–mrr)114::IS10 R (mcr–73::mini Tn10) 2 R(zgb–210::Tn 10)1 (Tets) endA1 (dcm)], штамм E. coli С3030 (NEB,Ipswich, MA, США) [MiniFlysY(CamR) / fhuA2 lacZ::T7 gene1[lon]ompTahpC galλatt::pNEB3–r1–cDsbC(SpecR, lacIq)∆trxB sulA11 R(mcr–73::miniTn10––TetS)2 [dcm]R(zgb–210::Tn10 ––TetS)endA1 ∆gor ∆(mcrC–mrr)114::IS10] и штамм E. coli BL21(DE3) (NEB,Ipswich, MA, США) [F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB– mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5–T7 gene 1 ind1sam7 nin5])]. Очистка ДНК осуществлялась по стандартной методике, с применением китNucleoSpin ExtractII (Macherey–Nagel, Германия).
Рестрикция и лигирование проводилисьпо стандартным протоколам фирмы “Fermentas”. При лигировании использовалась ДНК –лигаза фага Т4 (Fermentas).402.1.3.2. Приготовление питательных средДля приготовления 1л питательной среды LB навеску 10 г бактотриптона, 5 гдрожжевого экстракта и 10 г NaCl растворяли в дистиллированной воде и доводилираствором 5М NaOH до pH 7,3. Для приготовления 1л питательной среды SOB навеску 20г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 0,585 г NaCl, 0,185 KCl, 0,95 г MgCl×6H2O иMgSO4×7H2O растворяли в 1 л дистиллированной воды, доводили рН раствора 5M NaOHдо 7,3.
Далее растворы разливали по качалочным колбам и автоклавировали при 121°С втечение 30 мин.2.1.3.3. Приготовление буферных растворовБуфер М (50 мM Трис/HCl, 10 мM ЭДТА, 1 мM PMSF, pH 7.5); Буфер N (50 мMТрис/HCl, 100 мM NaCl, pH 8,0); Буфер P (50 мM Трис/HCl, 100 мM NaCl, 2 M мочевина,pH 8,0) и Буфер Q (50 мM Трис/HCl, 100 мM NaCl, 100 mM DTT, pH 8,0) былиприготовлены путём смешения стоковых растворов 1 M Трис, 4 M NaCl и 8 M мочевины сдистиллированной водой.
рН растворов доводили до указанных значений солянойкислотой и фильтровали через фильтр с порами диаметром 0,22 мкм. Все буферныерастворы для ВЭЖХ были приготовлены из HQ-H2O, фильтрованы с помощью фильтра сдиаметром пор 0,22мкм и дегазированы.2.1.3.4. Cинтез олигонуклеотидов для клонированияХимический синтез олигонуклеотидов выполняли твердофазным фосфоамидитнымметодом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиваниемолигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенныхфосфамидитов-5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов,активированныхтетразолом.Синтезпроводиливмасштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено(нагрузка20-30мкмоль/г).Использовалисинтетическийциклстандартногофосфоамидитного метода.ОлигонуклеотидыNdeIGGTGGTCATATGAGCGATAAACCGGATATGSapIGGTGGTTGCTCTTCCGCAGCTTTCACCCGCCTGShine-DalgarnoNcoIGAGGAGAATAACTAGGTGACCATGGGAATTCCTCGAGG41НазваниеTb4–int_FTb4–int_RXhoIRBS–1BamHIXhoINcoIPstIGATCCCTCGAGGAATTCCCATGGTCACCTAGTTATTCTCCTCTGCA RBS–2NcoIGGTGGTCCATGGTGTTTGGCTATCGCAGTAACGXhoIGGTGGTCTCGAGTTAGCGGCCGGGCGTCCANcoIGGTGGTCCATGGTGACTGAAACGATAAAAGTAAGXhoIGGTGGTCTCGAGTTATTGTGAATCGATAATACGCAlaAcTr–se–FAlaAcTr–se–RSerAcTr–se–FSerAcTr–se–R2.1.3.5.
Создание рекомбинантной плазмиды pER–Tb4–GyrДля приготовления вектора ДНК плазмиду pTWTN1 (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывали в40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМДТТ, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой SapI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера О (50 мМтрис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой NdeI (10ед.акт.) в течение 1ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15%агарозном геле вырезали из геля и переносили в 200 мкл буфера NT , растворяли при 50°Св течении 5-10 мин и наносили на колонку NucleoSpin Extract II.
Промывали буфером NT3 и элюировали 50 мкл буфера NE. Для приготовления гена Tβ4 проводилиамплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду pER–TEVrs–TB4 с искусственным геном Tβ4 (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров синтетические олигонуклеотиды Tb4–int_F и Tb4–int_R (по 60 пмоль каждого). ПЦРпроводили в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем каждый из четырехdNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед.
акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме:денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезали из геля ипереносили в 200 мкл буфера NT, растворяли при 50°С в течении 5-10 мин и наносили наколонку NucleoSpin Extract II.
Промывали буфером NT 3 и элюировали 50 мкл буфера NE,затем расщепляли теми же рестриктазами, которые использовали при приготовлениивектора, и выделяли целевой фрагмент из агарозного геля. Полученный синтетическийфрагмент с геном рекомбинантного человеческого Tβ4 в количестве 2 пмоль прибавляли краствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl,рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ рАТФ, 10 мМ дитиотреитол) и лигировали с помощью 10ед.акт.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
