Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1091859), страница 9

Файл №1091859 Диссертация (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов) 9 страницаДиссертация (1091859) страница 92018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 9)

Реакцию проводили при 25°С и тщательном перемешивании в течение 5ч. Образование конъюгата ПЭГ с Tβ4 контролировали с использованием методов ОФВЭЖХ и SDS-электрофореза в 13%-ном ПААГ по Лэммли [153].2.1.2.9. Масштабирование реакции ПЭГилирования дезацетилтимозина бета 4К 10 мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, рН 4,0), содержащегорекомбинантный дезацетилтимозин бета 4 в концентрации 1мг/мл, добавляли 80 мгцианборгидрида натрия и 80 мг пропиональдегидного производного ПЭГ (мольноесоотношение 1:4). Реакционную смесь тщательно перемешивали и инкубировали втечение 3 ч при 25°С.

Контроль образования моноПЭГилированного Tβ4 проводили сиспользованием метода ОФ ВЭЖХ.2.1.2.10. Очистка моноПЭГилированного Tβ4Реакционную смесь объемом 10 мл разбавляли в 10 раз дистиллированной водой инаносили на колонну «Диасорб» 130 С16Т, 8 мкм, 15 × 250мм. Разделение проводили вградиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (30−70% за 60 мин) в 0,1% ТФУ соскоростью 3,5 мл/мин. Фракции, содержащие более 98% моноПЭГилированного Tβ4,объединяли и лиофилизовали.2.1.2.11. Определение структуры модифицированного Tβ4Лиофилизованные производные Tβ4 в количестве 200 мкг (массу рассчитывали попептиду) растворяли в 50 мкл буфера (50 мМ Трис/HCl, рН 8,0), затем добавляли 5 мкл0,067 мг/мл раствора Asp-N-протеиназы (0,335 мкг) и инкубировали в течение 3 ч при37°С.

Протеолитическую смесь анализировали методом хромато-масс-спектрометрии.Расщепление ангиотензин-конвертирующим ферментом проводили сразу после обработкипептида Asp-N-протеиназой. К 55 мкл гидролизата добавляли 4 мкл 4 М NaCl до конечнойконцентрации 300 мМ и 5 мкл 0,03 мг/мл раствора ангиотензин-конвертирующего38фермента. Смесь инкубировали в течение 3 ч при 37°С и анализировали методом хроматомасс-спектрометрии.2.1.2.12. Тестирование стабильности аналогов Tβ4 и химически синтезированногоTβ4 с использованием сыворотки кровиСтабильность пептида определяли как время, за которое в сыворотке кровиоставалось 50% пептида от его исходного количества (T1/2). Количество оставшегосяпептида определяли как отношение площади хроматографического пика исследуемогообразца в момент времени t к площади хроматографического пика исследуемого образца вначальный момент времени (St/S0, где St −площадь пика исследуемого образца в моментвремени t, S0 – площадь пика исходного количества исследуемого образца).

Сывороткувыделяли из крови кролика в соответствии с рекомендациями, описанными в статье [154],расфасовывали по 50 мкл и замораживали при −70°С. Расфасованную сыворотку кровииспользовали однократно. Тестируемые образцы в количестве 50 мкг (по пептиду)растворяли в стерильном физиологическом растворе и вводили в концентрации 10 мг/мл в50 мкл сыворотки крови. Инкубировали течение 1−12 ч при 37°С. Смесь анализировалиметодом хромато-масс-спектрометрии.2.1.2.13. Аналитические методы контроляРазделение белков производили на электрофоретической системе PowerPac HC(BioRad, США) в 15%- и 13%-ном ПААГ по Лэммли [153]. Гели окрашивали растворомCoumassi R-250 (2,5 мг/мл) для проявления белка и 5%-ным раствором иодида бария дляокрашивания ПЭГ [155]. Анализ фракций, содержащих производные Тβ4, осуществляли спомощью ОФ ВЭЖХ на колонке Prosphere C18 300 A 5 µ (Alltech, США).

Пептидныепродукты реакции ПЭГилирования и ацилирования Tβ4 элюировали в градиентеконцентрации80%-ногоацетонитрила(30−70%,19мини15−50%,13мин,соответственно) в 0,1%-ной ТФУ со скоростью элюции 0,7 мл/мин. Пептидные продуктысиалирования элюировали в градиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (15−50%, 13мин) в 1% NH4OAc со скоростью 0,7 мл/мин при 25°С. Пептидные продукты реакцийпротеолиза элюировали в градиенте концентрации 80%-ного ацетонитрила (2-50% за20мин) с 0,1%ТФУ на колонке Prosphere C18 300 A 5 µ (Alltech, США) при 25°С.Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на приборе 6224 TOF LC/MS(Agilent Тechnologies, США).392.1.3.

Разработка интеин-опосредованного метода получения рекомбинантного Tβ4из ацетилированного гибридного белка in vivo2.1.3.1. МатериалыВ работе использовали Трис (трис(гидроксиметил)аминометан) (Panreac, Испания),хлорид натрия (Panreac, Испания), хлорид кальция (Panreac, Испания), фосфат натрия(Panreac, Испания), бромистый этидий (Sigma-aldrich, США), фосфорную кислоту(Panreac, Испания), гидроксид натрия (Panreac, Испания), соляную кислоту (Panreac,Испания), уксусную кислоту (Panreac, Испания), уксусный ангидрид (Sigma-aldrich,США), этанол (Panreac, Испания), ацетонитрил (Panreac, Испания), глицерин (Panreac,Испания), мочевину отечественного производства марки “ос.

ч.” и “х. ч.”; акриламид(Panreac, Испания), N,N' – метиленбисакриламид, персульфат аммония (Merck), АТР(Sigma-aldrich, США), dNTP (Sigma-aldrich, США), агарозу (Sigma-aldrich, США), агар(Panreac, Испания), дрожжевой экстракт (Panreac, Испания), бактотриптон (Panreac,Испания), бактоагар (Panreac, Испания), бромфеноловый синий (BioRad, США); N,N,N',N'тетраметилэтилендиамин (TEMED) (BioRad, США), Кумасси R 250 (BioRad, США),дитиотреитол (DTT) (Sigma-Aldrich, США), додецилсульфат натрия SDS (Sigma-Aldrich,США),Этилендиаминтетрауксуснаякислота(ЭДТА)(Sigma-Aldrich,фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (Sigma-Aldrich, США), глицинСША),(Sigma-aldrich,США), бромистый этидий (Sigma-aldrich, США), Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид(IPTG) (Sigma-aldrich, США).

Используемые штаммы E. coli ER2566 (NEB, Ipswich, MA,U.S.A.) [F–, λ–, fhuA2 (lon), ompT, lacZ::T7, genel gal sulA11 ∆ (mcrC–mrr)114::IS10 R (mcr–73::mini Tn10) 2 R(zgb–210::Tn 10)1 (Tets) endA1 (dcm)], штамм E. coli С3030 (NEB,Ipswich, MA, США) [MiniFlysY(CamR) / fhuA2 lacZ::T7 gene1[lon]ompTahpC galλatt::pNEB3–r1–cDsbC(SpecR, lacIq)∆trxB sulA11 R(mcr–73::miniTn10––TetS)2 [dcm]R(zgb–210::Tn10 ––TetS)endA1 ∆gor ∆(mcrC–mrr)114::IS10] и штамм E. coli BL21(DE3) (NEB,Ipswich, MA, США) [F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB– mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5–T7 gene 1 ind1sam7 nin5])]. Очистка ДНК осуществлялась по стандартной методике, с применением китNucleoSpin ExtractII (Macherey–Nagel, Германия).

Рестрикция и лигирование проводилисьпо стандартным протоколам фирмы “Fermentas”. При лигировании использовалась ДНК –лигаза фага Т4 (Fermentas).402.1.3.2. Приготовление питательных средДля приготовления 1л питательной среды LB навеску 10 г бактотриптона, 5 гдрожжевого экстракта и 10 г NaCl растворяли в дистиллированной воде и доводилираствором 5М NaOH до pH 7,3. Для приготовления 1л питательной среды SOB навеску 20г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 0,585 г NaCl, 0,185 KCl, 0,95 г MgCl×6H2O иMgSO4×7H2O растворяли в 1 л дистиллированной воды, доводили рН раствора 5M NaOHдо 7,3.

Далее растворы разливали по качалочным колбам и автоклавировали при 121°С втечение 30 мин.2.1.3.3. Приготовление буферных растворовБуфер М (50 мM Трис/HCl, 10 мM ЭДТА, 1 мM PMSF, pH 7.5); Буфер N (50 мMТрис/HCl, 100 мM NaCl, pH 8,0); Буфер P (50 мM Трис/HCl, 100 мM NaCl, 2 M мочевина,pH 8,0) и Буфер Q (50 мM Трис/HCl, 100 мM NaCl, 100 mM DTT, pH 8,0) былиприготовлены путём смешения стоковых растворов 1 M Трис, 4 M NaCl и 8 M мочевины сдистиллированной водой.

рН растворов доводили до указанных значений солянойкислотой и фильтровали через фильтр с порами диаметром 0,22 мкм. Все буферныерастворы для ВЭЖХ были приготовлены из HQ-H2O, фильтрованы с помощью фильтра сдиаметром пор 0,22мкм и дегазированы.2.1.3.4. Cинтез олигонуклеотидов для клонированияХимический синтез олигонуклеотидов выполняли твердофазным фосфоамидитнымметодом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиваниемолигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенныхфосфамидитов-5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов,активированныхтетразолом.Синтезпроводиливмасштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено(нагрузка20-30мкмоль/г).Использовалисинтетическийциклстандартногофосфоамидитного метода.ОлигонуклеотидыNdeIGGTGGTCATATGAGCGATAAACCGGATATGSapIGGTGGTTGCTCTTCCGCAGCTTTCACCCGCCTGShine-DalgarnoNcoIGAGGAGAATAACTAGGTGACCATGGGAATTCCTCGAGG41НазваниеTb4–int_FTb4–int_RXhoIRBS–1BamHIXhoINcoIPstIGATCCCTCGAGGAATTCCCATGGTCACCTAGTTATTCTCCTCTGCA RBS–2NcoIGGTGGTCCATGGTGTTTGGCTATCGCAGTAACGXhoIGGTGGTCTCGAGTTAGCGGCCGGGCGTCCANcoIGGTGGTCCATGGTGACTGAAACGATAAAAGTAAGXhoIGGTGGTCTCGAGTTATTGTGAATCGATAATACGCAlaAcTr–se–FAlaAcTr–se–RSerAcTr–se–FSerAcTr–se–R2.1.3.5.

Создание рекомбинантной плазмиды pER–Tb4–GyrДля приготовления вектора ДНК плазмиду pTWTN1 (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывали в40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМДТТ, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой SapI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера О (50 мМтрис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА) рестриктазой NdeI (10ед.акт.) в течение 1ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15%агарозном геле вырезали из геля и переносили в 200 мкл буфера NT , растворяли при 50°Св течении 5-10 мин и наносили на колонку NucleoSpin Extract II.

Промывали буфером NT3 и элюировали 50 мкл буфера NE. Для приготовления гена Tβ4 проводилиамплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду pER–TEVrs–TB4 с искусственным геном Tβ4 (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров синтетические олигонуклеотиды Tb4–int_F и Tb4–int_R (по 60 пмоль каждого). ПЦРпроводили в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем каждый из четырехdNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед.

акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме:денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезали из геля ипереносили в 200 мкл буфера NT, растворяли при 50°С в течении 5-10 мин и наносили наколонку NucleoSpin Extract II.

Промывали буфером NT 3 и элюировали 50 мкл буфера NE,затем расщепляли теми же рестриктазами, которые использовали при приготовлениивектора, и выделяли целевой фрагмент из агарозного геля. Полученный синтетическийфрагмент с геном рекомбинантного человеческого Tβ4 в количестве 2 пмоль прибавляли краствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl,рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ рАТФ, 10 мМ дитиотреитол) и лигировали с помощью 10ед.акт.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
А знаете ли Вы, что из года в год задания практически не меняются? Математика, преподаваемая в учебных заведениях, никак не менялась минимум 30 лет. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6367
Авторов
на СтудИзбе
310
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее