Диссертация (1091859), страница 13
Текст из файла (страница 13)
В качестве ацилирующего агента использовали ангидрид гексановойкислоты. Поскольку последний обладает низкой растворимостью в воде, в реакционнуюсмесь добавляли менее полярные, чем вода, растворители, такие как ацетонитрил ибутанол. В лаборатории биотехнологии ИБХ РАН был проведен многофакторныйэксперимент по исследованию зависимости выхода моногексаноилтимозина бета 4 отвремени реакции, рН среды, содержания бутанола и ацетонитрила при постояннойтемпературе 25С°(табл. 4). Результаты эксперимента, выполненного совсместно сЕсиповым Р.С., представлены в [164].Таблица 4.
Содержание моногексаноилтимозина бета 4 в реакционной смеси, %, через 3 чпосле начала реакции.С4Н9ОН, %AcCN, %015300153001530015303,0351572230*815264,55814820221018206,0610118151081415рН*Жирным шрифтом выделено максимальное накопление продукта.В результате многофакторного эксперимента были определены условия проведенияреакции (рН 3 реакционной смеси, 15% бутанола, 30% ацетонитрила, 25°С), при которыхсодержание моногексаноилтимозина бета 4 в реакционной смеси составило 30%.Следующей стадией исследований стало изучение кинетики реакции ацилированияприподобранныхранееусловиях(Рис.23).Исследованиекинетикиреакцииацилирования показало, что выход моногексаноилтимозина бета 4, так же, как и в случаеацетилирования дезацетилтимозина бета 4 [36], достигает определенного значения, послечего с течением времени увеличивается незначительно. При этом происходит накоплениепобочных продуктов реакции.
Для ацилирования Tβ4 ангидридом гексановой кислотыоптимальным временем инкубирования было 180 мин.58Рис. 23. Зависимость содержания продуктов реакции ацилирования от времени инкубациипри рН 3, 15% бутанола, 30% ацетонитрила и 25°С: 1 − дезацетилтимозин бета 4; 2 −моногексаноилтимозин бета 4; 3 − побочные продукты.Сучётомоптимальныхпараметровпровелимасштабированиереакцииацилирования. Гексаноилтимозин бета 4, полученный в ходе реакции, очищали спомощью полупрепаративной ОФ ВЭЖХ (Рис. 24).Рис. 24.
Анализ продуктов реакции ацилирования дезацетилтимозина бета 4 ангидридомгексановойкислоты.А−профильполупрепаративнойхроматографии:1−дезацетилтимозин бета 4, 2 – моногексаноилтимозин бета 4, 3−5 – побочные продуктыреакции; B – результаты аналитической ОФ ВЭЖХ фракций 2−5; С – масс-спектрфракций 2-5аналитической ОФ ВЭЖХ (см. материалы и методы).Первый пик на профиле полупрепаративной хроматографии относится к фракции,содержащей непрореагировавший дезацетилтимозин бета 4.
Пики под номерами 2, 3, 4 и 5соответствуют фракциям с одинаковой молекулярной массой 5018,55 Да (Рис. 24, С),59которые отличались временем удерживания (Рис. 24, В). Для определения структурыполученных аналогов Tβ4 проводили пептидное картирование (см. раздел «Определениеструктуры полученных аналогов Tβ4»). Как показало исследование, только втораяфракция содержала Tβ4, модифицированный по N-концевой альфа-аминогруппе.Остальные аналоги Тβ4 были продуктами модификации эпсилон-аминогрупп лизинов инами не исследовались. На основании приведённых выше результатов получен патентсовместно с Есиповым Р.С.
[165].2.2.2.2. Сиалирование дезацетилтимозина бета 4Полисиаловая кислота (ПСК) неиммуногенна и биодеградируема, кроме того,уменьшает иммуногенность самого модифицируемого белка.Модифицированныеполисиаловой кислотой молекулы белка не подвержены фагоцитозу, а время ихциркуляции в крови значительно увеличивается [166, 167]. В качестве сиалирующегоагента использовали бутиральдегидное производное полисиаловой кислоты (14 кДа).Реакция сиалирования протекает в две стадии: результатом первой является образованиенестабильной кратной связи −СH=N− (основания Шиффа), котороя на второй стадии привосстановлении цианборгидридом натрия переходит в прочную связь −CH2−NH− [168].Оптимальные условия для указанной реакции определяли экспериментально: путемизменения соотношения ПСК:белок от 1:1 до 10:1, а также рН (3−6) и содержанияацетонитрила (0−45%) при времени инкубирования реакционной смеси 3 ч (Рис. 25).Результаты эксперимента, выполненного совсместно с Есиповым Р.С., представлены в[164].Было обнаружено, что изменение рН раствора в диапазоне от 4,5 до 6,0 практическине влияло на выход сиалированного Tβ4, а при рН ниже 4,0 происходило разрушениеполисиаловой кислоты.
Поэтому все последующие эксперименты проводились сфиксированным значением рН выше 4,0. В результате исследований были подобранытакие условия реакции, при которых достигался 58%-ный выход моноконъюгата: 30%ацетонитрила, отношение ПСК:белок =5:1, рН 4,5−6,0. Увеличение концентрацииацетонитрилавыше30%неприводиломоносиалированного тимозина бета 4.60кзначимомуувеличениювыходаСодержаниемоносиалированноготимозина бета 4. %0% AcCN15% AcCN80706030% AcCN45% AcCN50403020100012345678910Мольное cоотношение ПСК/белокРис.
25. Зависимость содержания моносиалированного Tβ4 от мольного соотношенияПСК:белок при разной концентрации ацетонитрила и температуре 25°С.Далее была определена зависимость выхода моносиалированного Tβ4 от времениреакции (Рис. 26). Реакция сиалирования практически полностью останавливалась через180 мин; дальнейшее инкубирование раствора было нецелесообразно.Рис.
26. Кинетика реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4 при соотношениибелок:ПСК = 1:5, содержании ацетонитрила 30%, рН 4,5 и температуре 25°С.Затем была проведена наработка полупрепаративного количества сиалированногоTβ4 и очистка полученного аналога с помощью полупрепаративной ОФ ВЭЖХ (Рис. 27,А). При этом среди продуктов сиалирования Tβ4 было обнаружено несколько фракциймодифицированного пептида с различной молекулярной массой (Рис 27, В).
Связано этобыло с неоднородностью самого исходного реагента, в котором присутствовали еебутиральдегидные производные ПСК с молекулярной массой от 10 до 18 кДа, что иприводило к образованию продуктов сиалирования дезацетилтимозина бета 4 с разноймолекулярной массой. Фракции с 3 по 7, представляющие собой сиалированный Tβ4 смолекулярной массой от 18 до 13 кДа, объединяли и лиофилизовали.
Полученныйлиофилизат использовали для биологических исследований.На основании приведённых выше результатов получен патент совместно сЕсиповым Р.С. [169].61Рис. 27. Анализ продуктов реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4. A – профильхроматографической очистки продуктов путем ОФ ВЭЖХ. B – электрофорез фракций;цифры 1−9 − номера фракций; М – маркеры молекулярной массы белков (см. материалы иметоды).2.2.2.3. ПЭГилирование дезацетилтимозина бета 4Важным свойством модифицированных полиэтиленгликолем молекул белковявляется их высокая гидрофильность. Высокое содержание атомов кислорода позволяетмолекуле ПЭГ образовывать водородные связи с молекулами воды, что влечет за собойформирование "водного облака" вокруг модифицированной молекулы "ПЭГ - белок", засчет чего значительно увеличивается ее гидродинамический радиус [170-172], чтоповышает её растворимость и биодоступность, а также защищает молекулу от другихбелков (нейтрализующие антитела, комплемент) и от активного фаго- и эндоцитоза [173].На сегодняшний день фармацевтический рынок представлен широким спектромПЭГилирующих агентов.
В нашем эксперименте мы использовали пропиональдегидноепроизводное ПЭГ второго поколения с молекулярной массой 10 кДа (NOF Сorporation,США). Реакция ПЭГилирования по механизму аналогична реакции сиалирования: онаидет с образованием основания Шиффа и последующим восстановлением его62цианборгидридом натрия. Как и в случае сиалирования, использовали ацетонитрил вкачестве органического растворителя. Однако первые эксперименты показали, чтоиспользование ацетонитрила приводило к значительному увеличению доли ди- итриПЭГилированных продуктов в реакционной смеси, поэтому в дальнейших опытах отиспользования ацетонитрила мы отказались.
В качестве переменных параметровиспользовали рН среды и мольное соотношение ПЭГ:белок от 1:1 до 5:1 с шагом 0,5 (Рис.28). Все эксперименты проводили при постоянной температуре 25°С в течение 24 ч.Результаты эксперимента, выполненного совсместно с Есиповым Р.С., представлены в[164].Рис. 28. Зависимость содержания моноПЭГилированного Tβ4 в реакционной смеси отсоотношения ПЭГ:белок при 25°С при различных значениях рН: 1 − рН 4; 2 − рН 5; 3 − рН3В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что при значении рН4,0 и мольном соотношении ПЭГ:белок= 4:1 выход реакции ПЭГилирования достигал63% от теоретически возможного.Параллельно с определением оптимального мольного соотношения и рН средыисследовали кинетику реакции ПЭГилирования (Рис.
29). Проведенные исследованияпоказали, что при значении рН 4,0, соотношении ПЭГ:белок = 4:1 и 18 ч инкубированиядостигается максимальный выход ПЭГилированного Tβ4, равный 68%. Уменьшениевыхода целевого продукта в процессе реакции связано с образованием побочныхпродуктов, а именно ди – и триПЭГилированного Tβ4. Так же как и в случае предыдущиханалогов Tβ4 моноПЭГилированный Tβ4 был наработан в полупрепаративныхколичествах для биологических исслеований. На рисунке 30, А изображен профильполупрепаративной хроматографической очистки моноПЭГилированного Tβ4. Чистотуполученного конъюгата подтверждали методом электрофоретического анализа (Рис. 30,В).63Рис.
29. Кинетическая кривая ПЭГилирования Tβ4 при рН 4,0, 25°С и соотношениибелок−ПЭГ = 1:4Рис. 30. Анализ продуктов реакции ПЭГилирования Tβ4. A – профиль полупрепаративнойОФ ВЭЖХ: 1 − дезацетилтимозин бета 4, 2 – моноПЭГилированный Tβ4, 3 – побочныепродукты реакции; B − электрофорез фракций после полупрепаративной ОФ ВЭЖХ: М –маркеры молекулярной массы белков; 1–3 − номера фракций, Р – ПЭГ (см. метариалы иметоды).Известно, что молекула ПЭГ обладает высокой гидрофильностью и способнаобволакивать молекулу белка, придавая ей совершенно новую электрофоретическуюподвижность. Поэтому модифицированная молекула Tβ4 располагается в области 30 кДа,что не соответствует расчетной массе аналога 15 кДа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
