Диссертация (1090326), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Все измеренияпроводили при комнатной температуре. Кинетические константы (КМ* и Vmax) былиполучены анализом линейных участков кинетических кривых окисления (первых 30с) с использованием уравнения Лайнуивера-Бэрка.Анализ продуктов окисления соединений 36, 46a и 46b под действиемr12/15-LOX. Для анализа продуктов окисления аликвоты очищенного ферментногопрепарата r12/15-LOX инкубировали с субстратом (конечная концентрациясубстрата 50 мкМ) в 5 мл фосфатного буфера (рН 7,4) при комнатной температурев течение 35 мин. Гидропероксиды жирных кислот, образовавшиеся в процессереакции, восстанавливали до соответствующих гидроксильных производныхдобавлением боргидрида натрия (2 мг). После подкисления реакционной массы дорН 3, липофильные продукты экстрагировали EtOAc (2 х 1 мл).
Органическиеэкстракты объединяли, растворитель упаривали. Остаток растворяли в 0,5 млметанола и аликвоты (100 мкл) анализировали с помощью обращено-фазовойВЭЖХ. Анализ ВЭЖХ производных жирных кислот проводили на обращенной ипрямой фазах в системах растворителей МеОН/Н2О/СН3СООН (85:15:0,1 пообъему)ин-гексан/2-пропанол/СН3СООН(98,5:1,5:0,1.пообъему),соответственно. Хроматомасс-спектрометрический анализ продуктов окислениясоединений 36, 46a и 46bпроводили по методике описанной в разделеМатериалы и методы к главе 5.Введение фотоаффинной метки. Природную r12/15-LOX кролика (1,5нмоль) инкубировали с радиоактивным зондом 47b (75 нмоль, 1,5 мКи / ммоль) илиего немеченым аналогом 46b в 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) в течение1 мин при 0 oC.
Затем смесь облучали УФ-светом (254 нм) в течение 2 мин. Белок153высаживали добавлением 1 мл ацетона, охлажденного до -20 oC. Образецвыдерживали при -20 oC в течение 2 ч, центрифугировали (2 мин при 10000 об/мин)и осадок промывали, используя 1 мл MeOH/CHCl3 (1:2, по объему), 1 мл МеОН/Н2О(4:1, по объему) и 1 мл ацетона. Растворитель удаляли на вакуумной центрифуге илиофилизованный белок осадок хранили при -80 oC.Протеолитическоерасщеплениебелкаианализпептидов.Лиофилизованный белок диспергировали ультразвуком (30 с, 50 Вт) в 1 млбикарбонатного буфера (0,1 М NH4HCO3, рН 8,3) и подвергали протеолитическомурасщеплению по действием трипсина (соотношение трипсин: r12/15-LOX – 1:50, повесу) в течение ночи при 37 oС.
Полученные пептиды анализировали с помощьюВЭЖХнаобращеннойфазе.АнализВЭЖХпроводилинажидкостномхроматографе Shimadzu LC-6A, подключенного к SPD-6AV UV-VIS детектору придлине волны 215 нм, используя колонку Discovery BIO Wide Pore C18 150 х 4,6 мм(размер частиц 5 мкм) (Supelco, Германия), снабженную защитной колонкойразмером (20 х 4 мм, размер частиц 5 мкм). Пептиды элюировали сиспользованием сегментированного градиента CH3CN в H2O, содержащего 0,1%ТФК: 1-ый сегмент - 5 мин изократическое элюирование при 2% CH3CN (пообъему), 2-ой сегмент - линейное увеличение концентрации CH3CN от 2% до 45% втечение 55 мин, 3-ий сегмент - линейное увеличение концентрации CH3CN от 45%до 100% в течение 10 мин, и 4-ый сегмент: 10 мин изократическое элюированиепри 100% CH3CN.
Скорость потока элюента составляла 1 мл/мин. Элюатфракционировали и фракции (1 мл) проверяли на содержание радиоактивности,используя счетчик Wallac 1410 (Pharmacia, Финляндия).Масс-спектрометрический анализ пептидов протеолиза r12/15-LOX. ПослеВЭЖХ каждую из фракций упаривали в вакууме и остаток растворяли в 10 мклсмеси,содержащейCH3CN/H2O/TФК(50:50:0.1,пообъему).Масс-спектрырегиситрировали на масс-спектрометре MALDI-TOF (Voyager-DE PRO, AppliedBiosystems США), используя -циано-4-гидроксикоричную кислоту в качествематрицы.
Спектры были получены в линейном режиме с ускоряющим напряжениемв 20 кВ и задержкой в 100-200 нс в диапазоне m/z 500-14000. Для анализа данныхмасс-спектрометрических исследований была использована программа GPMAW(General Protein Mass Analysis for Windows, США). Точность масс-спектральногоанализа составляля ±1 Да. Структура аминокислотной последовательности r12/15LOX приведена в приложении 1.154Структурноемоделированиекомплексафермент/субстрат.Моделькомплекса r12/15-LOX с субстратом была создана на основе кристаллическойструктуры r12/15-LOX ретикулоцитов кролика [24] (PDB 1LOX).
Недостающие а.о.601-602, 210-211 и 177-187, а также субстрат – АК были помещены в молекулуфермента с помощью программы VMD [297] с последующей минимизацией энергиис использованием программы NAMD [233].Методики к разделу 5.1.2Мутагенез. кДНК r12/15-LOX (кодирующие регионы показаны в приложении 2)клонировали в вектор pQE-9 (Qiagen, Германия) между сайтами рестрикции SalI иHindIII (приложение 3). Для этой цели сайт рестрикции SalI был встроен в кДНКперед метионином с помощью ПЦР. Данная процедура приводила к модификациифермента в N-терминальной части: Met-Arg-Gly-(His)6-Gly-Ser-Val-Asp-LOX(Gly-Val), которая не отражалась на ферментвтивных характеристиках рекомбинантногопрепарата.ТочечныемутациивводилисиспользованиемкомплектаQuickChangeTM (Stratagene, Нидерланды). Для проведения полимеразной цепнойреакции использовали матрицу кДНК r12/15-LOX в векторе pQE-9 (30,9 нг),комплиментарные прямой (125 нг) и обратный (125 нг) праймеры (приложение 4),содержащие по 27 нуклеиновых оснований, рефкционный буфер (5 мкл,QuickChangeTM), дезоксирибо нуклеозидтрифосфаты dNTPs (2 мкл, 2мМ) и турбоДНК-полимеразу (1мкл, 1Ед/мкл, Invitrogen) в 50 мкл Н2О.
Для амплификациииспользовали 16 циклов, каждый из которых содержал три стадии: денатурацию(95о oС, 30 с), отжиг (55 oС, 60 с) и элонгацию (68 oС, 10 мин) с общейдлительностью реакции ПЦР 3 ч 45 мин. После расщепления матричного векторадействием DPN-I эндонукдеазы (1 мкл, 37 oС, 60 мин) бактерии трансформировали8-ю мкл реакционной смеси в 0,3 мл среды NZY (45 с при 42 oС затем 3 мин при0 oС), после чего смесь инкубировали 60 мин при 37 oС. Трансформированныебактерии высеивали (LB-Aгар, содержащий 100 мг/л ампицилина) и выращивали втечение ночи.
Первичные структуры плазмид, содержащие точечные мутации,подтверждали секвенированием ДНК. Для этого 5-10 клонов, экспремирующихмутантные препараты, проверяли на содержание ДНК мутантных липоксигеназскринингомсиспользованиемрестрикционногокартированияианализаактивности, для идентификации положительных каталитически активных клоновLOX. Экспрессию и очистку мутантных препаратов LOX проводили по методике,описанной для фермента дикого типа.155Получение рекомбинантных r12/15-LOX дикого типа и ее различныхмутантов. r12/15-LOX дикого типа и ее различные мутанты были полученыэкспрессией гибридных белков, содержащих 6xHis ТАГ в E.coli. Бактерии (XL-1Blue) трансформировали с использованием рекомбинантных плазмид.
Культуры (25 л) выращивали в среде LB, содержащей 100 мг/л ампициллина, при 37 oС втечение 16 ч, после чего индуцировали экспрессию рекомбинантного белкаприбавлением1мМизопропил-1-тио--D-тиогалактопиранозида(конечнаяконцентрация в растворе). Культуры выдерживали в течение еще 2 ч при 30 oС,бактерии осаждали, промывали (натрий-фосфатым буфером, содержащим 137 мМNaCl)иповторносуспендировалив30млтогожебуфера.Клеткигомогенизировали с использованием гомогенизатора высокого давления EmulsiflexC5(Avestin,Канада)итвердыйостатокосаждалицентрифугированием.Супернатант отделяли и наносили на колонку с никель-агарозой 0,4 мл (Qiagen,Германия).
Колонку промывали (2 х 2 мл) промывочным буфером (50 мМ NaH 2PO4,300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 8,0). Белки элюировали с колонки буфером дляэлюции (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 200 мМ имидазол, рН 8,0) (5 х 0,2 мл).Каждую из пяти фракций проверяли спектрофотометрически на липоксигеназнуюактивность. Фракции, проявляющие наибольшую ферментативную активность(фракции 2-4) объединяли, разбавляли 20 мМ Tрис-HCl буфером (рН 7,4) всоотношении 1:50 (по объему) и очищали на колонке с Q-сефарозой объемом 500мкл(AmershamBiosciences,Германия)спомощьюанионообменнойхроматографии. Для этого колонку промывали 2 мл 20 мМ Tрис-HCl буфером (рН7,4), и фермент элюировали раствором 120 мМ KCl в том же буфере. Фракции по0,25 мл отбирали и проверяли спектрофотометрически на липоксигеназнуюактивность.
При необходимости, препараты подвергали дополнительной очисткеанионообменной хроматографией на препаративной колонке Моно-Q (Pharmacia,Швеция) как описано ранее [231]. Для хранения (-80 oС) в ферментный препаратдобавляли 10% глицерин.Анализ ферментативной активности r12/15-LOX и мутантов. Кинетикуокисления соединений 22, 23 и 33 регистрировали спектрофотометрически какописано в методике к разделу 5.1.1.Анализ продуктов окисления. Продукты окисления соединений 22, 23, 33,34 выделяли, как описано в методике к разделу 5.1.1.
Анализ ВЭЖХ производныхжирных кислот осуществляли на обращенной и прямой фазах в системахрастворителей МеОН/Н2О/СН3СООН (75:25:0,1 по объему) и н-гексан/2-пропанол/156СН3СООН (95:5:0,.1, по объему), соответственно. Анализ ВЭЖХ исходныхсоединений 21, 33, 34 проводили на хиральной фазе либо на колонке Criralcel OB всистеме растворителей н-гексан /2-пропанол/ СН3СООН (97:3:0,1, по объему) длясоединений 33 и 44, и на колонке Criralpack AD с помощью системы растворителейн-гексан МеОН (98: 2, по объему) для метилового эфира 21.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
