Диссертация (1090326), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Моноселенид 52 и диселенид 51 получали в качествеосновных продуктов при кипячении реакционной смеси с обратным холодильником.Аналитические данные полученных соединений:2-[[2-Гидрокси-5-[4-гидрокси-3-[(2-гидрокси-2-оксоэтил)карбамоил]фенил]-селениноилоксиселкниноил-бензоил]амино]уксусная кислота (49а). Выход:0,939 г (1,58 ммоль); т.пл. 175-178 oC (с разл.). ИК: 3303, 3071, 2925, 2706, 2577,1715, 1599, 1551, 1426, 1300, 1249, 1067, 831, 671, 545.
УФ(0,1 NaOH): 227,20,263,80. 1H-ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО): 12,63 (с, 2H, СООН), 8,32 (д, J = 2,0 Гц, 2H,6-Н), 7,81 (дд, J = 10,0 Гц, 2H, 4-Н), 7,11 (д, J = 8,0 Гц, 2H, 3-Н9,21 (т, J = 11,0 Гц, 2H,NH),), 3,99 (д, J = 5,8 Гц, 4Н, СН2).С-ЯМР (100,5 МГц, d6-ДМСО): 170,95, 167,22,13161,54, 139,01, 131,17, 127,31, 117,96, 116,41, 41,31. ДанныеSe-ЯМР (76,20 МГц),77элементного анализа и масс-спектрометрии высокого разрешения приведены втаблице 2 (раздел 4.2).6-[[2-гидрокси-5-[4-гидрокси-3-[(6-гидрокси-6-оксо-гексил)карбамоил]фенил] селениноилоксиселкниноил-бензоил]амино]гексановая кислота (49b).Выход: 63%, т.пл. 126-128 oC. 1H-ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО): 13,16 (с, 1H, СООН),9,04 (т, 1H, NH), 8,30 (д, 1H, Ar-H),7,82 (дд, 1H, Ar-H), 7,10 (д, 1Н, Ar-H), 3,29 (м, 2Н,СН2), 2,21 (т, 2Н, СН2), 1,53 (м, 4Н, СН2), 1,31 (м, 2Н, СН2).С-ЯМР (100,5 МГц, d6-13ДМСО): 167,83, 162,52, 138,59, 130,87, 126,31, 118,04, 115,74, 38,96, 33,57, 28,51,25,98, 24,20.
ДанныеSe-ЯМР (76,20 МГц), элементного анализа и масс-77спектрометрии высокого разрешения приведены в таблице 2 (раздел 4.2).3-Карбамоил-4-гидрокси-бензолселениновая кислота (50c). Выход: 63%, т.пл. 154-156 oC. 1H-ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО): 13,40 (с, Н, ОН), 8,60 (с, 1H, NH), 8,32(д, 1H, NH), 8,06 (с, 1H, Ar-H), 7,83 (дд, 1H, Ar-H), 7,11 (д, 1Н, Ar-H).С-ЯМР (100,513МГц, d6-ДМСО): 170,81, 163,38, 138,45, 131,17, 126,99, 118,12, 115,01. ДанныеSe-ЯМР (76,20 МГц), элементного анализа и масс-спектрометрии высокого77разрешения приведены в таблице 2 (раздел 4.2).3-Этоксикарбонил-4-гидроксибензолселениновая кислота (50d). Выход:17%, т.пл. 122-123 oC.
1H-ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО): 8,23 (д, 1Н, Ar-H), 7,93 (дд, 1H,Ar-H), 7,16 (д, 1H, Ar-H), 4,30 (дд, 2H, СН2), 1,36 (т, 3Н, СН3). 13С-ЯМР (100,5 МГц, d6ДМСО): 167,88, 162,24, 139,37, 132,89, 128,12, 118,08, 113,75, 61,66, 14,01.149ДанныеSe-ЯМР (76,20 МГц), элементного анализа и масс-спектрометрии77высокого разрешения приведены в таблице 2 (раздел 4.2).2-Гидрокси-5-селенинобензойная кислота (50e). Выход: 15%, т.пл. 140142 oC (с разл.). 1H-ЯМР (400 МГц, d6-ДМСО): 8,23 (д, 1H, Ar-H), 7,90 (дд, 1H, ArH), 7,12 (д, 1Н, Ar-H).С-ЯМР (100,5 МГц, d6-ДМСО): 171,12, 163,40, 139,06,13132,94, 128,44, 117,84, 113,48.
ДанныеSe-ЯМР (76,20 МГц), элементного анализа77и масс-спектрометрии высокого разрешения приведены в таблице 2 (раздел 4.2).5-(3-карбокси-4-гидроксифенил)диселанил-2-гидроксибензойная кислота(51). Выход: 13%, т.пл. 275 oC (с разл.) (лит. данные [295]: 231-235 0C). 1H-ЯМР (400МГц, d6-ДМСО): 7,92 (д, H, Ar-H), 7,54 (дд, 1H, Ar-H), 6,81 (д, 1Н, Ar-H).С-ЯМР13(100,5 МГц, d6-ДМСО): 170,84, 162,42, 139,40, 135,54, 118,14, 117,74, 116,37.ДанныеSe-ЯМР (76,20 МГц), элементного анализа и масс-спектрометрии77высокого разрешения приведены в таблице 2 (раздел 4.2).5-(3-карбокси-4-гидроксифенил)селанил-2-гидроксибензойнаякислота(52).
Выход: 7%, т.пл. 262 C (с разл.) (лит. данные [296]: 272 C), H-ЯМР (400 МГц,o01d6-ДМСО): 7,85 (д, 1H, Ar-H), 7,58 (дд, 1H, Ar-H), 6.93 (д, 1Н, Ar-H).С-ЯМР (100,513МГц, d6-ДМСО): 160,75, 170,90, 140,26, 134,77, 119,25, 118,77, 114,35. ДанныеSe-ЯМР (76,20 МГц), элементного анализа и масс-спектрометрии высокого77разрешения приведены в таблице 2 (раздел 4.2).150Эксперимент к главе 5Материалы и общие методыВработепроизводителей:Германия);использовалисьборгидрид13(S)-HpODE,химическиенатрия(Serva,соединенияГермания);следующихампициллинизопропил-1-тио--D-тиогалактопиранозид(Gibco,(IPTG),арахидоновая и линолевая кислоты, стандарты ВЭЖХ – 12(S)- и 15(S)-HETE, Nнитрозометилмочевина, бис(триметилсилил)трифторацетамид (BSTFA) и трипсин(Sigma, Германия); 10% Pd/CaCO3 (Aldrich, Германия); растворители для ВЭЖХ(Merck, Германия или Baker, Нидерланды), Трис, ТЕМЕД, SDS и Кумасси R-250(Carl Roth GmbH, Германия).
Фаг Т4 лигаза, Pwo-полимераза и комплекты длясеквенирования (Boehringer, Германия); штамм Escherichia HB 101 (Invitrogen,CШA), эндонуклеазы (New England Biolabs, Германия), плазмида pQE-9 (Qiagen,Германия), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты dNTPs (Carl Roth GmbH, Германия).Синтез олигонуклеотидов проводили на фирме BioTeZ (Германия). Концентрациюбелка определяли с помощью аналитического комплекта Roti-Quant (Carl RothGmbH, Германия). Точечные мутации вводили с использованием комплектаQuickChangeTM (Stratagene, Нидерланды).
ДНК выделяли с помощью комплектаQIAprep Spin Miniprep KIT (No.27106) (Quiagen, Германия). Анализ ВЭЖХ продуктовферментативного окисления субстратов проводили на жидкостнм хроматографеShimadzu LC 6A с детектором Hewlett Packard 1040A. Разделение производныхжирных кислот проводили на колонке Nucleosil C-18 (Macherey-Nagel, Германия;250 х 4 мм, размер частиц 5 мкм) и предколонки (30 х 4 мм, 5 мм размер частиц) всистеме растворителей МеОН/Н2О/СН3СООН (различного состава в зависимостиот типа продуктов) и скорости элюента 1 мл/мин. ВЭЖХ на прямой фазе проводилина колонке Nucleosil 100-7; 250х4 мм, размер частиц 5 мкм (Machery-Nagel,Германия) в системе растворителей н-гексан/2-пропанол/СН3СООН (различногосостава в зависимости от типа продуктов) и скорости элюента 1 мл/мин.
ВЭЖХ напрямой фазе проводили на колонке Nucleosil 100-7 (Macherey-Nagel, Германия; 250х4мм,5мкмразмерчастиц)всистемерастворителейн-гексан/2-пропанол/СН3СООН (95:5:0,1, по объему) и скорости элюента 1 мл/мин. Газовуюхроматографию/масс-спектрметрию методом электронного удара (EI) проводили наприборе Shimadzu GC-MS QP-2000 (Япония), оснащенном капиллярной колонкой(30 м х 0,32 мм, толщина покрытия 0,25 мкм) при температуре инжектора 280 oC,температуреисточникаионов180 oCиэнергииэлектроновв70эВ.Модифицированные жирные кислоты элюировали изотермически при 180 oC в151течение 2 мин, затем от 180 до 290 oC со скоростью 5 oC/мин.
Для анализапроизводные жирных кислот, предварительно выделенные методом ВЭЖХ,метилировалисиспользованиемдиазометанаигидроксильныегруппысилилировали с использованием BSTFA (бис(триметилсилил)трифторацетамида).Дляполученияболееинформативныхмасс-спектров,метилированныепроизводные полиеновых жирных кислот (10 мкг) растворяли в 1 мл этанола игидрировали при комнатной температуре с использованием 5 мг 10% Pd/CaCO3 вкачестве катализатора. Раствор фильтровали, растворитель упаривали и продуктысилилировали, как описано выше.
Аликвоты образцов (2 мкл) использовали дляанализа. Для оксиграфических измерений был использован оксиграф Strathkelvin781 (Strathkelvin Instruments, Великобритания). Для проведения электрофорезаиспользовали камеры и источник питания фирмы Bio-Rad (Германия).Методики к разделу 5.1.1Выделение природной r12/15-LOX кролика. r12/15-LOX выделяли изобогащенной ретикулоцитами суспензии клеток крови кролика осаждениемсульфатомаммония,гидрофобнойхроматографиейианионообменнойхроматографией на препаративной колонке Моно-Q (Pharmacia, Швеция) какописаноранее(электрофорез)[231].иКонечныйактивность30препаратферментаимелс-1 приокисленииЛК.чистоту>95%Аминокислотнаяпоследовательность r12/15-LOX кролика приведена в приложении 1.SDS-ПААГ электрофорез.
Электрофорез в денатурирующих условиях (SDSПААГ) проводили с использованием следующего протокола. Для приготовленияконцентрирующего геля использовали 4 мл концентрата Rothiphorese (Carl RothGmbH, Германия), содержащего 30% акриламид и 0,8% бисакриламид, 3 млбуфера для разделяющего геля (1,5 М Tрис, 0,6% SDS, рН 8,8), 0,02 мл ТЕМЕД,0,12 мл 10%-ного персульфата аммония и 5 мл воды. Для приготовленияконцентрирующего геля использовали 1,35 мл концентрата Rothiphorese (Carl RothGmbH, Германия), содержащего 30% акриламид и 0,8% бисакриламид, 2,5 млбуфера для концентрирующего геля (0,5 М Tрис, 0,6% SDS, рН 6,8), 0,02 млТЕМЕД, 0,1 мл 10%-ного персульфата аммония и 6 мл воды. Стоковый буфер дляэлектрофореза (5-и кратный, рН 8,3) содержал Tрис (75,5 г), глицин (360 г), 0,1%SDS (25 г) в 5 л воды.
Для подготовки образцов для электрофореза использовали 8мкл 4-х кратного загрузочного буфера (Carl Roth GmbH, Германия), примерно 100мкг белка в 24 мкл 0,1М Трис. Смесь выдерживали 10 мин при 95 oС, охлаждали,послечегоиспользовалидляпроведения152электрофореза.Электрофорезпроводили при 25 мА (60 В) на стадии концентрирования и при 120 В на стадииразделения в течении 90 мин. Для фиксации и окрашивания геля использовалираствор Кумасси R-250 (0,4 г) в 20 мл МеОН, 40 мл уксусной кислоты и 140 млводы.
Для отмывки использовали смесь 20 мл МеОН, 40 мл уксусной кислоты и 140мл воды. Для более чувствительного проявления использовали серебряноеокрашивание по стандартной методике.Анализ ферментативной активности r12/15-LOX. Кинетику окислениясоединений 36, 46a и 46b регистрировали спектрофотометрически, измеряяизменение интенсивности поглощения при 235 нм в диапазоне концентрацийсубстратов 10-300 мкМ. Ферментативную реакцию инициировали добавлениемфермента (15 мкг) к смеси, содержащий различные концентрации субстрата (ввиде натриевой соли), в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
