Диссертация (1090326)
Текст из файла
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГООБРАЗОВАНИЯ«МОСКОВСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»На правах рукописиИвановИгорь ВладимировичСтруктурные и каталитические свойства ферментов перекисногоокисления липидов – 12/15-липоксигеназ02.00.10 – биоорганическая химияДиссертацияна соискание ученой степенидоктора химических наукМосква – 2016ОГЛАВЛЕНИЕОГЛАВЛЕНИЕ……………………………………………………………………………...……..2ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………………...6АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ И ЦЕЛЬ РАБОТЫ…………………………………………..7НАУЧНАЯ НОВИЗНА………………………………………………………………………….…8ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ……………………………………………………….……...9АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ………………………………………………….…9ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА…………………………………………………………………..…..10ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫ…………………………………………………………………..……10ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ…………………….....…12Глава 1.
Структурные основы катализа под действием LOX………………………….....121.1. Липоксигеназы млекопитающих представляют собой единуюполипептидную цепь, которая организована в виде двухдоменнойструктуры; в низших организмах встречаются гибридные белки…………...141.2. Малый N-терминальный домен LOX является важным структурнымэлементом, отвечающим за мембранное связывание и каталитическуюактивность…...……………………………………………………………………….171.3.
С-Терминальный домен LOX содержит субстрат-связывающий карман икаталитически активное негемовое железо…………….................…….…....181.4. Междоменная подвижность как источник структурной гибкости LOX……...201.5. Связывание лиганда с активным центром 12/15-LOX кролика приводит кконформационным изменениям белковой матрицы……………………….....201.6. Субстрат-связывающий карман LOX является гидрофобной полостью свыходом на поверхность белка………………………………………….………..221.7.
Молекулярный кислород проникает в активный центр LOX посредствомстрого контролируемых механизмов…………................................................261.8. Первичная структура LOX играет ключевую роль в реакционнойспецифичности окисления жирных кислот………………………………...……271.9. Антароповерхностный характер и стереоконтроль липоксигеназнойреакции………………………………………………………………………………..281.10. Геометрия трех ключевых аминокислот определяет позиционнуюспецифичность 12/15-липоксигеназ (концепция триады)…………………….311.11.
Реакционная специфичность 15LOX2 человека и ее ортолога (8S-LOXмыши) не может быть объяснена концепцией триады……………………….331.12. Реакционная специфичность изоформ LOX зависит отэкспериментальных условий.…………………………………………………......341.13. Суицидальная инактивация LOX…………………………………………………341.14. Аллостерический характер LOX………………………………………...………..371.15. Структура LOX в растворе…………………………………………………………382Глава 2. Эволюция LOX…….………………………………………………………………......402.1. Гены, кодирующие последовательность липоксигеназ, обнаружены вэукариотах и бактериях, но не найдены в археях…………………………......402.2. Существует ли общий прототип LOX?............................................................422.3.
Биологическая роль изоформ LOX……………….……………………………...43Глава 3. Будущее и перспективы развития исследований в области структурнойбиологии LOX…………………………………………………………………………..44Глава 4. Химический синтез зондов активного центра липоксигеназ............................474.1. Полный химический синтез терминальных и субтерминальныхзамещенных производных арахидоновой кислоты…………………..….….…474.1.1. Синтез региоизомерных по положению гидроксигруппы терминальныхацетиленов……………………………………………….…………………….…484.1.2. Синтез замещенных оптически активных производныхарахидоновой кислоты…………………..……………………………………...504.1.3.
Синтез терминальных и 2 субтерминальных замещенныхпроизводных арахидоновой кислоты……………………………………….544.2. Синтез зондов активного центра на основе ингибиторов r12/15-LOX……..55Глава 5. Изучение взаимодействия r12/15-LOX с лигандом ……………..…...……...625.1. Исследования r12/15-LOX с использованием аналогов их природныхсубстратов………………………………………………………………….……...…625.1.1. Введение фотоаффинной метки в r12/15-LOX………………………...….625.1.2. Энантиоселективное окисление r12/15-LOX региоизомеров ПНЖКгидроксилированных в субтерминальной части молекулы………….…...665.2. Исследования r12/15-LOX с использованием ингибиторовлипоксигеназного окисления …………………………………………..………....69Глава 6.
Роль кислорода в реакциях с участием липоксигеназ…….……………………726.1. Бифазный характер скорости окисления 19-НЕТЕ под действием r12/15LOX…………………………………………………………….……………………....726.2. Кинетическое моделирование и оценка кинетических параметров………..746.3. Расчетная модель механизма транспорта кислорода в 12/15-LOX наоснове симуляции молекулярной динамики и метода неявноголиганда……………………………………………………………………………..…77Глава 7.
Изучение пространственной структуры r12/15-LOX в растворе….…………..837.1. Вклад контактов между N-терминальным и каталитическим доменамиr12/15-LOX в стабильность вторичной и третичной структурбелка………………………………….………………………………….…………....837.1.1. Анализ взаимодействия N-концевого и каталитического3доменов………………………. ………..…………………………………..….837.1.2. Функциональная роль Тyr98 N-терминального домена……………..……857.1.3. Структурные изменения фермента при мутациях Тyr98 и Тyr614……….857.1.4.
Роль N-концевого домена в стабилизации подвижной 2 спирали…..897.1.5. Анализ третичной структуры и динамики конформационныхизменений r12/15-LOX дикого типа и мутантов..…………………….....907.1.6. Вклад Arg403 в стабильность структуры r12/15-LOX…………………….937.1.7. Функциональная роль Arg403 в структуре r12/15-LOX……….………….967.2.Исследование межмолекулярных контактов r12/15-LOX в растворе……..1037.2.1. Термодинамическая устойчивость димеров липоксигеназы…………...1037.2.2. Влияние внешнего окружения на структуру r12/15-LOX в растворе…..1047.2.3. Влияние лиганда на структуру и структурную подвижность r12/15LOX……………………………………………………………………...……...1067.2.4.
Исследования интерфейса в димере r12/15-LOX с применениемметода малоуглового рассеивания рентгеновских лучей инаправленного мутагенеза…………………………………………………1097.2.5. Изучение устойчивости димеров фермент-субстратного комплексаr12/15-LOX и мутантов с использованием методов молекулярнойдинамики………………………………………………………………..……….1137.2.6. Влияние межмолекулярных контактов в димерном интерфейсебелка на ферментативные свойства r12/15-LOX…………………….…1167.2.7.
Роль аминокилотных остатков 18 спирали в конформационныхпереходах r12/15-LOX……………………………….…...……………….…118ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………………………...…..121ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………………….….123ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ…………………………………………………………..….125Эксперимент к главе 4………………………………….……………………………..….125Материалы и общие методы ………………………………………………..….125Методики к разделу 4.1.1……………………….……………………………..….126Методики к разделу 4.1.2……………………….……………………………..….132Методики к разделу 4.1.3………………………….…………………………..….143Методики к разделу 4.2………………………………………………………..….148Эксперимент к главе 5…………………………………………….…………………..….151Материалы и общие методы ………………………………………………..….151Методики к разделу 5.1.1……………….……………………………………..….152Методики к разделу 5.1.2…………………………….………………………..….155Методики к разделу 5.2………………………………………………………..….1574Эксперимент к главе 6……………………….………………………………………..….159Материалы и общие методы ………………………………………………..….159Методики к разделу 6.1………………………………………………………..….159Методики к разделу 6.2………………………………………………………..….159Методики к разделу 6.3………………………………………………………..….164Эксперимент к главе 7 ………………………………………………………………..….168ПРИЛОЖЕНИЯ…………………………………..………………………………………….……175СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………….……………………………………………….……189БЛАГОДАРНОСТИ……………………………………………………….……………….……...191СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ193Основные результаты данной работы изложены в следующих публикациях:Обзоры…………………….…………………………………………………………..………193Экспериментальные статьи…………………………..…………………………….……...
193Тезисы докладов на научных конференциях………………….………………..………196СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………..………1995ВВЕДЕНИЕАКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫЛипоксигеназы млекопитающих (LOX) – негемовые железосодержащие ферменты– непосредственно связаны с регуляцией физиологических процессов и липидногогомеостаза живой клетки [1-4]. Они селективно окисляют полиненасыщенныежирные кислоты (ПНЖК) с образованием серии биологически активных соединений– оксилипинов, являющихся как эффекторами активации сигналов биологическогоответа на то или иное событие, происходящее на внутриклеточном уровне, так имежклеточнымивторичнымимессенджерами,действующимипосредствомсигналов трансдукции [5-10].
Расшифровка генома человека показала наличиешести функциональных генов, кодирующих структуры различных липоксигеназныхизоферментов, которые отличаются по своим структурным и функциональнымсвойствам [11]. 5-LOX вовлечена в биосинтез лейкотриенов и, тем самым, играетважную роль в патогенезе воспалительных и аутоиммунных заболеваний [10, 12,13]. Другие изоферменты, такие как 12- и 15-LOX, и их продукты принимаютучастиевпроцессахвозникновенияиразвитияатеросклероза[14,15],дифференциации клеток и их метастазирования [16-19], а так же воспаленияжировой ткани и возникновения резистентности к инсулину [20, 21].
Ключевая рольлипоксигеназ в патогенезе воспалительных и гиперпролиферативных заболеванийсделала их потенциальной мишенью при лечении многих заболеваний. Напротяжении последних 20 лет были предприняты многочисленные попыткисоздания препаратов на основе ингибиторов биосинтеза оксилипинов. Так,ингибиторы 5-LOX [22] и ряд антагонистов рецепторов лейкотриенов в настоящеевремя получили допуск к медицинскому применению в качестве «анти-астматиков»[23,24].Что касаетсягруппыингибиторов изоферментов 12-и 15-LOXмлекопитающих, то ни один из препаратов, предложенных на их основе, не прошелклинических испытаний вследствие их низкой специфичности и ряда побочныхэффектов [25]. Необъясненными остались аллостерические свойства 12/15-LOX,которыепредусматриваютфермента лигандом,неналичиеальтернативныхукладывающихсявединственного субстрат-связывающего центрарамкимеханизмовактивацииобщепринятоймоделифермента.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
