Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1090326), страница 7

Файл №1090326 Диссертация (Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов – 1215-липоксигеназ) 7 страницаДиссертация (1090326) страница 72018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 7)

Для12/15-LOX концепция триады дает возможность достаточно простого объясненияих реакционной специфичности. Эта гипотеза, первоначально предложенная дляr12/15-LOX [91], предполагает, что ПНЖК располагаются в субстрат-связывающемкармане по принципу «хвостом вперед» (рис. 6) и карбоксильной группой снаружи вобластиArg403.Основаниесубстрат-связывающегокарманафермента,содержащего лиганд, ограничено триадой аминокислот Phe353, Ile418 и Ile593, приэтом геометрия их боковых цепей определяет положение молекулы ПНЖК вактивном центре. В случае, когда аминокислотные остатки в этих положенияхимеют небольшие по объему боковые цепи, ПНЖК способна проникать глубже всубстрат-связывающий карман, при этом отщепление водорода в положении С10является предпочтительным (12-липоксигеназное окисление).

Напротив, еслибоковые цепи аминокислотных остатков триады достаточно объемны, водородотщепляется преимущественно в положении С13 (15-липоксигеназное окисление)(рис. 7). Исследования в области направленного мутагенеза подтверждаютправомерность применения гипотезы триад к 12/15-LOX человека (h12/15-LOX)[111,112], r12/15-LOX кролика [111, 92], 12/15-LOX обезьяны [113], 12/15-LOX31орангутанга [113], 12/15-LOX мыши [114], 12/15-LOX крысы [115] и 12/15-LOXсвиньи [116]. Вклад в позиционную специфичность каждой из компонент триадынепостоянен и изменяется в зависимости от типа фермента.

Для человека иорангутанга Phe353 и Ile418 (нумерация r12/15-LOX) принадлежат к группедетерминант первого порядка, так как они оказывают наибольшее влияние напроцессы позиционирования субстрата в активном центре. Их замена нааминокислотные остатки с менее объемными боковыми группами превращает 15LOX исключительно в 12-липоксигеназу. Для 12/15-LOX мыши отдельные мутациикомпонентов триады вызывают лишь незначительные изменения позиционнойспецифичности;наибольшийодновременноеэффект[113].введениеИсследованиянескольких5-LOXмутацийчеловекавызываетпоказали,чтоодновременное введение нескольких мутаций по положению компонентов триадыувеличивалодолю15S-окисления.Так,длякомплексногомутантаF359W+A424I+N425M+A603I 15(S)-HpETE была идентифицирована в качестведоминирующего продукта окисления [117].

Хотя природа изменений, происходящихв геометрии активного центра, неизвестна, полученные данные свидетельствуют отом, что 5-LOX может быть превращена в 15-липоксигенирующий ферментуменьшениемобъемасубстрат-связывающегокармана[117].Данныеисследований в области мутагенеза компонентов триад 12R-LOX мыши [107] и 15LOX2 человека [113] не поддерживают эту концепцию, показывая тем самым, чтоона не отражает свойства LOX эпидермального типа. Компьютерная моделькомплекса LOX1 сои с ЛК [109] предполагает, что метильный конец ПНЖКпроникает вглубь субстрат-связывающего кармана, вступая в контакт с Phe557,который соответствует второй компоненте триады (Met419) фермента кролика ипредставленв13-липоксигеназахрастительногопроисхожденияобъемнымостатком Phe. Напротив, в 9-LOX его место занимает меньший по размерамостаток Val. Исследования в области направленного мутагенеза на примере 13SLOX огурца подтверждают роль вышеуказанного аминокислотного остатка впозиционной специфичности LOX [100, 118].Основываясь на квантово-механических расчетах электронной структуры имоделировании молекулярной динамики, была создана улучшенная моделькомплекса r12/15-LOX с ПНЖК [119, 120].

Результаты расчетов показали наличиесвободного пространства в активном центре фермента, которое обеспечиваетвариабельность конформации молекул ПНЖК, в особенности по отношению кположению системы двойных связей. Согласно этой модели, АК расположена вактивном центре таким образом, что pro-S-атом водорода при С10 локализован32ближе к акцептору протона фермента (Fe3+–OH-), чем pro-S-атом водорода приС13. Хотя в процессе окисления АК отщепление pro-S-водорода от С13 являетсяпредпочтительным, авторы работы предполагают, что это происходит вследствиеэнергетических и стерических затруднений в положении С10. На основе расчетовквантовой и молекулярной механики, а также с помощью методов молекулярнойдинамики для r12/15-LOX кролика было показано, что присоединение кислорода вположении [+2] (при С13-атоме углерода линолевой кислоты) имеет более низкийэнергетический барьер, чем в положении [-2] (при С7) благодаря стерическимзатруднениям, создаваемым остатками Leu597 и Glu548.1.11.

Реакционная специфичность 15-LOX2 человека и ее ортолога (8SLOX мыши) не может быть объяснена концепцией триады. Несмотря на тотфакт, что 15-LOX2 человека и 8S-LOX мыши обладают различной позиционнойспецифичностью, они являются ферментами–ортологами с высокой степеньюидентичности аминокислотной последовательности (78%). Два аминокислотныхостатка, Asp602 и Val603 в 15-LOX2 человека (Tyr603 и His604 в 8S-LOX мыши) былиидентифицированы как основные детерминанты, определяющие позиционнуюспецифичность этих ферментов [121]. Напротив, мутации аминокислот, входящих втриаду, оказывают незначительное влияние на реакционную особенность изоформLOX эпидермального типа [113].

Различия между 15-LOX2 человека и 8S-LOXмыши можно объяснить, если предположить различия в ориентации субстрата вактивном центре [104, 121]. 15-LOX2 человека связывает АК по принципу «хвостомвперед», при этом водород отщепляется от С13-атома углерода, что в условиях[+2]-радикальной перегруппировки приводит к введению кислорода в положениеС15 (рис. 7). Напротив, 8S-LOX мыши связывает АК «головой вперед», при этомотщепление водорода происходит при С10 атоме и сопровождается [-2]радикальной перегруппировкой с присоединением кислорода в положении С8.Остаток His604, который расположен в области основания субстрат-связывающегокармана, обеспечивает взаимодействие с карбоксильной группой жирной кислоты инеобходим для обратной ориентации субстрата [121].1.12.Реакционнаяэкспериментальныхспецифичностьусловий.ИзменениеизоформpHLOXбуфера,зависитотвыбранногодляпроведения ферментативной реакции, оказывает сильное влияние на позиционнуюспецифичность LOX растений [104, 122, 123].

Несмотря на то, что колебаниявеличины pH часто происходят in vivo, об их влиянии на специфичность LOXживотных на физиологическом уровне известно не так много. Исследование33зависимости профиля продуктов окисления ПНЖК рядом LOX позвоночных отзначения рН показало его относительную стабильность в диапазоне рН, близком кфизиологическому[105].Структурныеизмененияврезультатеточечногомутагенеза, а также изменения концентрации субстрата, наоборот, могут вызыватьpH-зависимость специфичности ферментативной реакции некоторых изоформLOX.

Так, для мутанта V603H 15-LOX2 человека 8S-липоксигенирование являетсядоминирующим (65%) при pH < 7, тогда как 15(S)-HpETE образуется, главнымобразом, при рН ≥ 8. Аналогичным образом, структура продуктов 8S-LOX мышидикого типа не изменяется в близком физиологическом диапазоне значений рН,тогда как замена His604 на Phe вызывает рН-зависимое изменение позиционнойспецифичности.Эти вместе взятые данные свидетельствуют о том,чтоспецифичность LOX определяется условиями среды протекания ферментативнойреакции, однако с биологической точки зрения роль этого явления остаетсянеизученной.1.13.

Суицидальная инактивация LOX. Большинство млекопитающих LOX[124, 125], а так же другие ферменты биосинтеза эйкозаноидов [126-134]подвергаются быстрой инактивации в процессе окисления ПНЖК. Для лейкотриенA4 гидролазы было показано, что пептиды активного сайта этого ферментаковалентно модифицируются в процессе инактивации [134]. Если некоторыеизоформы LOX, такие как 12-LOX тромбоцитарного типа различных видовмлекопитающих [125, 133] устойчивы к суицидальной инактивации, другиеизоформы LOX [124, 125, 134-141] весьма чувствительны к этому процессу. Хотямолекулярныймеханизмсуицидальнйинактивацииявляетсяпредметомобсуждения в течение многих лет, до настоящего времени не было предложенообщего механизма, позволяющего описать этот процесс.

На самом деле,анализируя литературные данные, можно сделать вывод о том, что не один, анесколько альтернативных механизмов вносят вклад в суицидальную инактивацию:1) Синкаталитическая инактивация. В этом случае фермент инактивируется поддействием радикальных интермедиатов, образующихся в ходе реакции LOX. Вусловиях гипобарических концентраций кислорода или анаэробных условиях,аллильныеотщепленияилипентадиенильныеводорода,могутрадикалы,вступатьвобразующиесяковалентноевпроцессевзаимодействиесаминокислотными остатками, образующими полость субстрата-связывающегокармана.

Аналогичным образом, гидропероксиды ПНЖК, которые также являютсяпромежуточными продуктами липоксигеназной реакции, могут быть ответственныза синкаталитическую инактивацию фермента. Тем не менее, обладая более34продолжительным временем жизни, они могут покинуть активный центр фермента,модифицируя поверхностные пептиды или окружающие ксенобиотики [142, 143]. 2)Посткаталитическая инактивация. В этом случае фермент реагирует сгидропероксидами ПНЖК, образующимися в процессе реакции фермента ссубстратом.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6367
Авторов
на СтудИзбе
309
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее