Диссертация (1090326), страница 11
Текст из файла (страница 11)
16). Масштабирование хроматографической методикипозволяло выделить оптически чистые энантиомеры 16НЕТЕ (оптическая чистота>99%)вколичестведонесколькихдесятковмиллиграмм.Конфигурациюасимметрической ОН-группы подтверждали измерением угла оптического враще1Введениерадиоактивной метки проводили в Институте молекулярной генетики РАН53ния с последующим сравнением экспериментальных данных с литературными(21а): метиловый эфир 16(R)-НЕТЕ []D21 +6 (с 0,7, ацетон); 21b, 16(S)-энантиомер[]D21 -6 (с 0,7, ацетон) (лит. данные []D23 -5.4 [205]). Для определенияконфигурации хирального центра в соединениях 25а и 25b использовалигидрированиеэнантиомероввсоответствующиететраеноаты,идентичныесоединениям 21а и 21b.
17(S)-НЕТЕ (33b) и ее моноацетиленовый аналог (34b)получалинаоснове(R)-энантиомераинверсиейхиральногоцентрасиспользованием реакции Мицунобу [205, 219] или полным химическим синтезомисходя из (R)-эпихлоргидрина как описано для соединений 31 и 32.В силу того, что высокая удельная радиоактивность [5,6,8,9,11,12,14,15-3H8]17(R)-НЕТЕ (30), необходимая для ряда биологических исследований, затрудняетее использование при проведении дальнейших модификаций в препаративноммасштабе, 14,15-дегидро-16- (26) и 14,15-дегидро-17-НЕТЕ (34) были выбраны вкачестве предшественников азидов.
Введение азидогруппы проводили черезсоответствующие п-толуолсульфонаты [220], что приводило к инверсии хиральногоцентра.Синтезчерезбромидысохранялисходнуюконфигурациюасимметрического центра, однако замещение бромида на азид происходило неполностью. Важно отметить, что каталитическое восстановление тройной связиазидов 38а и 38b на катализаторе Линдлара в сухом бензоле не затрагивалоазидогруппу, тогда как использование метанола приводило к восстановлениюазида в амин [221, 222]. Кислоты [14,15-3Н]-17-N3-ЕТЕ (39а и 39b) были получены свысокой удельной активностью ~40 Ки/моль и по своим свойствам идентичнынемеченым производным 36а и 36b, синтезированным на основе 17-НЕТЕ [212].Использование энантиомеров 16-НЕТЕ (21) и их 14,15-дегидроаналогов (25) врамках предложенной схемы приводило к образованию лишь следовых количествцелевых продуктов вследствие низкой стабильности и высокой реакционнойспособности аллильных ипропаргильных азидов.синтетическихипроблемнизкойВ силу вышеуказанныхстабильности,-4замещенныеазидопроизводные АК в проведении дальнейших исследований не использовались.4.1.3.
Синтез терминальных и 2 субтерминальных замещенныхпроизводныхарахидоновойкислоты.Восновусинтезановыхазидо-производных 46 и их меченых тритием аналогов 47 положена методология,разработанная для соединений 16- (22) и 17-НЕТЕ (33) (Схемы 4 и 5). rac(5Z,8Z,11Z,14Z)-19-(44b)иrac-(5Z,8Z,11Z,14Z)-18-Гидрокси-5,8,11,14-эйкоза-тетраеновые (44а) кислоты использовались в качестве ключевых промежуточныхсоединений (Схема 6). (5Z,8Z,11Z,14Z)-20-Гидрокси-5,8,11,14-эйкозатетраеновая54кислота (44с) была использована в работе без дальнейших модификаций.
Изсоображений безопасности введение азидогруппы в молекулу радиоактивномеченыхгидроксикислот45[радиохимическаячистота>95%иудельнаярадиоактивность в 160 Ки/ моль] проводилось с использованием образцовразбавленных немечеными аналогами 44 в соотношении 1:100. Конечные продукты47 были получены с выходом ~26% по 2-м стадиям с удельной радиоактивностью винтервале0,79-1,6Ки/моль[217].Идентичностьрадиоактивно-меченыхсоединений 47 их немеченым аналогам 46 показана с помощью аналитическойВЭЖХ.Схема 6Условия: (a) CBr4, PPh3, CH2Cl2, 20oC, 1 ч; (b) 8, CuI, NaI, K2CO3, ДМФ, 20oC; (c) H2/3H2катализатор Линдлара, бензол, 10oC; (d) NaOH, MeOH-H2O, 20oC; (e)TsCl, CH2Cl2,Py, 20oC, 24 ч; (f) NaN3, ДМФ, 75-80 oC, 3,5 ч4.2.
Синтез зондов активного центра на основе ингибиторов r12/15-LOXИспользование ингибиторов является распространенным подходом приисследованиикаталитическогоцентрафермента,связывающихдоменоврегуляторных белков и пр. С целью изучения механизмов взаимодействия в рядуr12/15-LOX–лиганд были получены новые соединения 48-52, дизайн которыхоснован на сходстве с известными ингибиторами 5-LOX и r12/15-LOX (рис. 17),55Рис. 17. Структуры ингибиторов r12/15-LOХтаких как целутон (53) [23], эбселен (54) [223, 224] и салициловая кислота (55) [225].(Z)-Изомер метилового эфира 2-бензилиден-3-оксо-2,3-дигидробензо[b]тиофен-7карбоновой кислоты (BODTCM) (48)2 получали реакцией тиондоксила (56) сбензальдегидом (57) (Схема 7) [226].
Облучение раствора (Z)-BODTCM в ДМСОпри405нмприводилокизомеризациидвойнойсвязис образованиемфотостационарной смеси (pss). Определение количественного соотношения Z- и Eизомеров в смеси pss (Z/E=38:62) проводили с помощью 1Н-ЯМР спектроскопиисравнением интенсивности сигналов винильных протонов с химическим сдвигомСхема 7Условия: (a) бензальдегид (57), 4М HCl в диоксане, 20oC; (b) MeOH, 70oC, 1,5 ч; (c)облучение при 405 нм.2Выполненосовместно с Институтом химии Технического университета, г. Берлин,Германия.56=7,96 и =7,73 м.д.
для Z- и E- изомеров, соответственно. (Е)-BODTCM (48b)выделяли хроматографическм разделением смеси pss препаративной ВЭЖХ. УФспектры каждого из изомеров 48а и 48b характеризовались наличием двухмаксимумов поглощения при 320 и 436 нм, и 320 и 455 нм, соответственно.Соединения, содержащие связи типа Se-N, Se-O, помимо связывания сактивным центром фермента (прямое ингибирующее действие), обладают такжередокс-потенциаломи,следовательно,могутоказыватьнепосредственноевоздействие на степень окисления каталитического железа, восстанавливаяфермент в его в неактивную Fe2+-форму. С целью создания новых потенциальныхселеносодержащихингибиторовLOX,обладающихвосстанавливающимисвойствами, предложен синтез новых 5-селенопроизводных салициловой кислоты49-52 с использованием тетрахлорида селена (Схема 8) [227, 228].
ВодныйСхема 8Условия: (a) SeCl4, TГФ, 20oC, 1 ч; (b) H2О, 20oC, 24ч; (c) SeCl4, TГФ, 70oC, 1 ч.гидролиз промежуточных 5-арилтрихлоридов селена, полученных в мягкихусловиях, приводил к образованию 5-арилпроизводных селенистой кислоты (50c-e)и/или ангидридов (49a-b). В отличие от ранних исследований [229], используясовременные методы физико-химического анализа (ЯМР, масс-спектроскопиювысокогоразрешенияирентгеноструктурныйанализ)образования5-арилтригидроксида селена обнаружено не было. Следует отметить, что только в57случае, когда монозамещенные амиды салициловой кислоты (55) содержалисвободную карбоксильную группу, в реакции образовывались соответствующиеангидриды 49a-b (Схема 8).
Эти данные свидетельствовали о возможностипротекания так называемой самопроизвольной этерификации в присутствиизаместителя, содержащего свободную карбоксильную группу. Это предположениекосвенно подтверждалось данными масс-спектрометрии высокого разрешениясоединения 50e, для которого массовое число (m/z 264,96031), соответствующеемолекулярному иону метилового эфира, было получено при использованииметанола в качестве растворителя (рис 18).
В более жестких условиях прикипячениивТГФпромежуточные5-трихлорселенильныепроизводныесалициловой кислоты разлагались с образованием смеси «желтого» диселенида51 и «белого» моноселенида 52, которые разделяли с помощью флешхроматографи и охарактеризовывали с помощю спектровдвумерной гетеро-ядернойсоединениябыли77Se-ЯМРС-ЯМР и13H/ C корреляции (HMQC) (рис. 19 и 20). Все1выделены13вспектральными данными включаякристаллическомвиде,охарактеризованыSe-ЯМР (таблица 2), физико-химическими77константами и данными рентгеноструктурного анализа (для соединений 50c-e).Таблица 2.
Физико-химический анализ соединений 49-52.Соединение(брутто формула)49a(C18H15N2O11Se2)49b(C26H32N2O11Se2)50c(C7H7NO4Se)50d(C9H10O5Se)50e(C7H6O5Se)51(C14H10O6Se2)52(C14H10O6Se)Элементный анализнайдено / вычисленоМасс-спектрывысокого разрешения77Se-ЯМРH(%)2,71/2,34C(%)36,38/36,51N(%)4,71/4,45найдено(m/z)594,9009вычислено(m/z)594,9012(м.д.)11824,85/4,5744,24/44,203,88/3,97709,0409709,040611772,86/2,8434,16/33,895,65/5,65247,9474247,946811773,45/3,6439,07/39,01-276,96209276,9620711762,72/2,4333,46/33,75-248,93021248,9307711752,23/2,3338,86/38,91-432,87284432,873505022,82/2,8547,48/47,61-352,95614352,9569839758Рис.
18. Масс-спектр высокого разрешения соединения 50e в MeOH59Рис. 19. 77Se-ЯМР спектры соединений 51 (верхняя панель) и 52 (нижняя панель).60Рис. 20. 13С-ЯМР спектры соединения 51 (верхняя панель) и фрагмент ЯМР-спектрадвумерной гетеро-ядерной 1H/13C корреляции (HMQC) соединения 52 (нижняяпанель).61Глава 5. Изучение взаимодействия r12/15-LOX с лигандом3,45.1. Исследования r12/15-LOX с использованием аналогов их природныхсубстратов5.1.1.Введениеразработаннойфотоаффиннойстратегииисследованияметкивструктурныхr12/15-LOX.элементовВосновуфермента,непосредственно взаимодействующих с молекулой ПНЖК, положен принципподобия структур природного субстрата LOX – АК и синтезированных азидо-ETE.Кинетический анализ параметров окисления фотоаффинных зондов 36 и 46a-bпоказал, что параметры окисления 19-азидо-ETE (46b), КМ* 10,9 мкМ и kcat 20 сек-1,наиболее близко сопоставимы с характеристиками, полученными для АК (рис.
21А).Анализ ВЭЖХ продуктов окисления соединения 46b подтвердил образованиеосновного продукта с максимумом поглощения при 235 нм (рис. 21Б), чтохарактерно для сопряженного диенового хромофора с (Z,E)-конфигурацией.Присутствиенезначительныхколичествпобочногопродуктасовременемудерживания 9,9 мин и максимумом поглощения при 231 нм свидетельствовало оналичии (Е,Е)-геометрии двойных связей в его структуре. Хотя, в случае 17-азидоЕТЕ (36) и 18-азидо-ETE (46а) основная доля продуктов окисления и содержалаОН-группуприC-15,наличиерядапобочныхизомерныхпродуктовсвидетельствовало о более низкой степени субстратной специфичности реакции.Таким образом, на основе высокого субстратного сходства с АК 19-азидо-ETE и еемеченый тритием аналог (46b и 47b) были выбраны в качестве фотоаффинногомаркера.
Вследствие более низкой субстратной специфичности 17-азидо- и 18азидо-ETE для проведения дальнейших экспериментов не использовались. Вцелях оптимизации процесса (рис. 21В) было исследовано влияние температуры,продолжительности УФ-облучения, а также мольное соотношение количеств[фермент/зонд] в диапазоне от 1:1 до 1:1000 на эффективность введения метки. Воизбежание неспецифической маркировки было выбрано соотношение 1:50. В этих3Выполненов Институте биохимии Медицинского университета Charité, г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
