Диссертация (1090326), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Более того, константы связывания 13(S)-HpODE (KAM) и2+15-гидроперокси-19-НЕТЕ (KPM) с восстановленной формой фермента (EFe ) такжеотличаются друг от друга в три раза, что позволяет предположить, что эндогенныйпероксид является менее эффективным активатором по сравнению с 13(S)-HpODE.Таким образом, предложенная нами расширенная кинетическая модель впервыеучитывает двойственную роль кислорода в липоксигеназной реакции; он служит нетолько субстратом, но и может быть активатором фермента, что является егоновой ранее не описанной функцией в случае липоксигеназ.766.3. Расчетная модель механизма транспорта кислорода в 12/15-LOX наоснове метода неявного лиганда5.Ферментативнаяреакцияхарактеризуетсяr12/15-LOXобразованиемпродуктов окисления с S-конфигурацией асимметрического центра.
В случаепроизвольного распределения молекул газа в структуре белка, контролируемогодиффузией,необходимоналичиеособыхмеханизмовстереоконтроля,2+предусматривающих смещение электронной плотности в комплексе EFe -S• таким2+образом, чтобы образование асимметрического центра в EFe -SOO• происходило встрого определенной конфигурации [246]. Напротив, для ряда оксидаз (цитохром Соксидазы,холестериноксидазыидр.)былапредложенавозможностьсуществования механизмов контролируемого транспорта кислорода [247–249].Подобный канал был также постулирован для LOX1 сои [93, 97], что также неисключало существования механизмов контролируемого транспорта кислорода и вr12/15-LOX.
Тот факт, что в липоксигеназной реакции кислород может служить нетолько в качестве субстрата, но является активатором фермента, требуетдетального изучения механизмов его проникновения в реакционный центр LOX.Для решения этой задачи на основе кристаллической структуры фермента, несодержащей лиганда [31], с использованием метода неявного лиганда [250] быласоздана 3D-карта распределения энергии Гиббса G(O2) в молекуле r12/15-LOX(рис. 29А) [251]. Карта распределения свободной энергии показала, что вовнутренних регионах субстрат-связывающего кармана G(O2) наиболее низка, чтосвидетельствует о высокой вероятности нахождения в них кислорода.
Глобальныйминимум свободной энергии (-19,8 кДж/моль) находится непосредственно напротивакцептора водорода (Fe3+-OH), показывая, что концентрация O2 в областиактивного центра (желтый пунктир) в ~100 раз превышает соответствующуюконцентрацию в эквивалентном объеме растворителя (1Å3). Использованиеалгоритма ступенчатого затопления энергетического «ландшафта» позволилореконструировать области с минимальной энергией и выделить три основных пути,соединяющие поверхность белка с областью высокого сродства к O2 в активномцентре (рис.
29Б). Канал 1, характеризующийся самым низким барьером,начинаетсявнижнейчастисубстрат-связывающегокарманаидостигаетповерхности белка в области аминокислотных остатков Leu408 и Ile414. Второй канал5Выполненов Институте биохимии Медицинского университета Charité, г. Берлинсовместно с группой биофизики под руководством проф.Х.Г. Хольцхюттера.77Рис 29. Свободное распределение энергии для определения вероятностинахождения кислорода в r12/15-LOX кролика. (А) Наложение четырехизоповерхностей свободной энергии с уровнями энергии -12,1, -9,5, -7,0 и -3,0 кДж/моль(от темно к светло фиолетовому цвету). (Б) Оптимальные маршруты транспортакислорода в молекуле r12/15-LOX (молекула АК показана с целью улучшенияориентации). (B) Оптимальные маршруты транспорта кислорода в комплексе r12/15LOX с АК.
(Г) Энергетическиий профиль каналов 3 и 4.представляет собой саму полость субстрат-связывающего кармана. В отсутствиилипидного субстрата этот канал является свободным от каких-либо энергитическихистерическихограниченийдляпроникновениякислорода.Третийканалсоединяется с активным центром с противоположной стороны белковой молекулы.Его энергетический профиль характеризуется наличием двух барьеров в областибоковой цепи Lеu367. В отличие от полости субстрат-связывающего кармана, канал3 представляет собой отдельные, преимущественно гидрофобные полости,непостоянно связанные друг с другом в результате конформационной подвижностиостатков окружающих их аминокислот.
Когда субстрат (АК) присутствует в модели(рис. 29В), изменений в области высокого сродства к кислороду, а такжеместоположении глобального минимума энергии не происходит. При этом узкийвход субстрат-связывающего канала закрывается, препятствуя проникновениюкислорода. Канал 1 также исчезает. Однако, открывается четвертый канал,соединяющий активный центр с поверхностью белка между Trp145 и His426. Тотфакт, что область максимальной концентрации кислорода и каталитическийкомплекс Fe3+-ОН расположены по разные стороны молекулы ПНЖК, согласуется сантароповерхностнымхарактеромлипоксигеназнойреакции,прикоторомотщепление водорода и введение кислорода происходит с противоположных78Таблица 8.
Ферментативные характеристики мутантов r12/15-LOXферментkcat (с-1)kcat/KM*(S)KM(О2)kcat/KM*(О2)(с мкМ)-1(мкМ)(с мкМ)-1дикий тип13,7±0,40,74±0,085,2±2,42,63±1,22L367K0,3±0,010,08±0,019,0±1,80,03±0,01L367E2,2±0,20,26±0,069,0±2,10,24±0,06L367F5,6±0,40,73±0,0740,1±3,80,14±0,02L367W4,4±0,20,48±0,057,0±3,20,63±0,29сторон молекулы АК. Более того, вероятность нахождения кислорода в радиусе 2Åот С-15 атома АК в 7 раз выше, чем в области C-11, что предполагаетпреимущественное окисление по С-15.
Канал 3 являлся функциональным как вслучае фермента, не содержащего лиганд, так и его комплекса с субстратом. Сцелью экспериментального подтверждения функциональной роли канала 3 былипредпринятыпопыткиизменитьегопроводимостьпутемнаправленногомутагенеза. Для этой цели аминокислоту Leu367, находящуюся в областиэнергетических барьеров, замещали на аминокислоты, несущие объемные (L367Fи L367W), а также заряженные (L367K и L367E) боковые заместители.
АнализВЭЖХ показал, что точечные мутации не оказывали практически никакого влиянияна профиль продуктов окисления: для r12/15-LOX и ее мутантаов 15-Н(р)ЕТЕявлялась основным продуктом окисления (рис. 30). Для оценки влияния точечныхмутаций на кислородную проводимость канала 3 были определены величины kcat иКМ*(O2) (табл. 8) и рассчитаны значения kcat/KM*(O2), определяющие влияниемутации на диффузию кислорода. Для фермента дикого типа, значение КМ*(O2)составляло 5,2±2,4 мкM, что соответствовало литературным данным. МутацияL367K вызывала значительное уменьшение kcat и была исключена из дальнейшегорассмотрения.ДлямутантовL367F,L367EиL367W,каталитическаяэффективность находилась на уровне величины, полученной для фермента дикоготипа, но отношение kcat/KM*(O2) существенно снижалось.
Наибольшие изменениянаблюдались для L367F, для которого величина kcat/KM*(O2) уменьшалась болеечем в 20 раз, тогда как значение KM*(O2) возрастало в 10 раз по сравнению с KM*(O2)фермента дикого типа. С механистической точки зрения воздействие Phe367 на79проводимость канала 3 можно объяснить исходя из динамики флуктуаций белковойматрицы и распределения свободной энергии.
В случае мутанта наблюдаетсяРис. 30. Анализ ВЭЖХ продуктов окисления арахидоновой кислоты поддействием r12/15-LOX и ее мутантов на обращенной фазе. Методика выделенияпродуктов и аналитические условия приведены в экспериментальной части.частичное перекрытие канала за счет нескольких кластеров молекул воды внепосредственной близости от Phe367. Для мутанта L367F (рис. 31Б и 31Д)молекулы воды W1 и W2 были иммобилизованы, образуя стабильную сеть, котораявключает водородные связи с Glu370 и Arg405.
Несмотря на то, что остаток Leu367способен вращаться более или менее свободно, конформация Phe367 неизменялась в процессе моделирования. Для фермента дикого типа, напротив,водные кластеры не привязаны к определенному сайту гидратации (рис. 31А и31С). Результаты полученных экспериментальных и теоретических исследованийпоказываютвозможностьстрогоконтролируемого80транспортакислородавРис. 31.
Влияние природы аминокислотного остатка в областиэнергетического барьера (Leu367) на транспорт кислорода в молекуле r12/15LOX и траекторию его диффузии. (А и С) фермент дикого типа; (Б и Д) мутантL367F.81молекулеr12/15-LOXчерездинамическиеполости,соединяющиеучасткиповерхности белка с областью глобального минимума энергии, находящегося вкаталитическом центре r12/15-LOX.827. Изучение пространственной структуры r12/15-LOX в растворе7.1. Вклад контактов между N-терминальным и каталитическим доменамиr12/15-LOX в стабильность вторичной и третичной структур белка67.1.1.АнализхарактеравзаимодействияN-концевогоикаталитического доменов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
