Диссертация (1090326), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Молекула r12/15-LOX представляет собой единуюполипептидную цепь, организованную в виде двухдоменовой структуры [31].Рис. 32. Вклад Тyr98 в междоменовое взаимодействие в r12/15-LOX. (A)Аминокислотные остатки, вовлеченные в нековалентное взаимодействиедоменов r12/15-LOX (2P0M). (Б) Водородные связи между N-терминальным икаталитическим доменами согласно PISA. (В) Анализ аминокислотнойпоследовательности и гомология липоксигеназ позвоночных.6Выполненов Институте биохимии Медицинского университета Charité, г. Берлин и накафедре экспериментальной медицины и биохимии Университета Tor Vergata, г. Рим,Италия83Хотя в кристалле оба домена тесно связаны друг с другом, в растворе (Nтерминальный домен обладает достаточно большой степенью подвижностиотносительно каталитическго домена [90, 252].
Использование программы PISA[253] (www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver) позволило более детальноохарактеризовать взаимодействие между двумя структурными единицами r12/15LOX (PDB 2P0M), разделяющих совместную площадь контакта в 777 A2 [254].Несмотря на то, что 805 А2 приходится на каталитический домен (21 аминокислота)и 749 A2 на N-концевой домен (23 аминокислоты), было выявлено лишьнезначительное число а.о., которые участвуют в непосредственном контакте междудоменами (рис. 32Б). На этом фоне можно выделить Tyr98, вклад которогосоставляет ~10% в общую среднюю величину поверхности контакта (табл. 9).Таблица 9.
Вклад различных аминокислотных остатков в поверхность контактамежду N-терминальным и каталитическим доменамиN-терминальный доменаминокислотныйостатокC-терминальный доменплощадьконтакта (Å2)аминокислотныйостатокплощадьконтакта (Å2)Ser1345,46Leu 12472,55Ile1458,08Phe 12567,44Tyr1525,93Val 16347,53Leu 6146,84Asp 16461,54Phe 6255,77Leu 16860,07Trp 9461,42Glu 16966,86Pro 9629,04Aasp 17053,68Tyr 9880,63Ile 38329,25Trp 10070,25Lys 38830,67Pro 11060,65Glu 61229,76Val 11132,28Glu 61361,79Gly 11252,42Tyr 61447,30Ser 61665,65Кроме гидрофобных и ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, ароматическое кольцоTyr98 может вступать в электронное взаимодействия с Тyr614 каталитическогодомена (рис. 32А). В кристаллической структуре (PDB 2P0M, конформер А)ароматические кольца обоих тирозинов находятся на расстоянии ~4,1 Å2 (~3,7 Å2 в84PDB 2P0M, конформер Б), что в случае подвижности N-терминального доменаможет приводить не только к Т-образному, но и параллельному взаимодействиюэтих двух остатков.
Анализ гомологии аминокислотной последовательностипоказывает, что Тyr98 (нумерация r12/15-LOX) инвариантен во всех липоксигеназахмлекопитающих, в то время как Тyr614 сохраняется только в 12/15-LOX, а в другихизоферментах присутствует в виде His (рис. 32В). Эти данные позволяют сделатьвывод о том, что как , так и -катионнные взаимодействия, которые характерныдля большинства белков [255–258], могут играть особую роль при взаимодействииструктурных доменов всех изоформ LOX млекопитающих.7.1.2. Функциональная роль Тyr98 N-терминального домена.
С цельюизучения функциональной роли ароматического аминокислотного остатка вположении 98 Тyr98 заменяли генно-инженерными методами на Phe, которыйсохраняет ароматический характер боковой цепи, но не способен образовыватьводородные мостики с каталитическим доменом (рис. 32Б), а также нейтральныйAlaиположительнозаряженныйArg.Исследованиеферментативныххарактеристик мутантов (рис.
33А) показало, что отсутствие ОН-группы ваминокислотном остатке даже слегка повышает активность фермента (мутантY98F). Это позволяет предположить незначительную роль водородной связи вмеждоменовом взаимодействии. С другой стороны, наличие нейтрального илизаряженного остатков приводит к существенному снижению каталитическойактивности.
Наиболее значительное понижение активности наблюдалось в случаеY98R мутанта. В силу сильного ингибирования в области концентраций субстрата>10 мкМ кинетика окисления ЛК под действием Y98R не описывалась уравнениемМихаэлиса-Ментена, при этом специфичность образования продуктов окисленияоставалась не измененной. Мутация Y98R также понижала способность ферментак мембранному связыванию; в отличие от фермента дикого типа, 50% белкамутанта оставалось в цитозоле. Эти данные хорошо согласуются с результатами,полученнымипривведенииаффиннойметки(раздел5.1.1,Табл.3)иподтверждают участие аминокислотных остатков поверхности междоменовогопространства в процессах связывания с биомембранами и, возможно, с липиднымсубстратом.7.1.3.
Структурные изменения фермента при мутациях Тyr98 и Тyr614.Сравнение КД-спектров мутантов по Тyr98 с r12/15-LOX дикого типа не выявилосущественных различий во вторичной структуре белка. Более того, спектры85Рис. 33. (А) Кинетические кривые зависимости скорости ферментативнойреакции r12/15-LOX и мутантов. (Б) Хроматография фермента дикого типа имутантов на анионобменной колонке Resource Q (6 мл); вставка: изоэлектрическоефокусирование. (В) Аналитическая гель-фильтрация рекомбинантных белков;вставка: определение гидродинамического радиуса (Rh) молекул белка. Величины Kavбыли рассчитаны на основе уравнения Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo), где Ve объем растворителятребуемый для элюирования белка, Vo мертвый объем колонки и Vt общий обьемколонки. (Г) Сопоставление кристаллической структуры мономера r12/15-LOX соструктурами низкого разрешения r12/15-LOX дикого типа и мутантов в растворе,полученных с использованием метода МРР.статическойфлуоресценциибылипрактическиидентичными,чтосвидетельствовало о незначительном влиянии мутации на глобальную третичнуюструктуру.
Природная r12/15-LOX имеет значение pI 5,5 [231], тогда как длярекомбинантного фермента дикого типа это значение несколько выше, pI 5,7 (рис.33Б, вставка). Сходные значения были получены для мутантов Y98F, Y98A и Y614R(рис. 33Б, вставка). В случае мутанта Y98R наряду с основным сдвигом величиныpI требовалась более высокая ионная сила буфера для элюирования образца санионообменной смолы (аналитическая хроматография). Этот результат позволилпредположить,чтовведениеположительнозаряженногоArgуменьшаетсуммарный отрицательный заряд белка, что возможно только в условиях86раскрытия междоменового интерфейса (рис. 32А и 32Б). Аналитическая гельфильтрация позволила обнаружить увеличение гидродинамического радиуса (Rh)мутанта Y98R на 2 Å (32,8 Å) по сравнению с величиной Rh, рассчитанной дляТаблица 10. Сравнительный анализ величин гидродинамического радиуса ирадиуса вращения фермента дикого типа и мутантовгельфильтрацияБелокданные МРРRh (Å)Rg (Å)долямономеров(%)WT30,831,993Y614R30,832,787Y98R32,8--Y614R+Y98R34,138,573фермента дикого типа (30,8 Å) (рис.
33В, Таблица 10) [254]. Напротив, мутацииY614R, как одного из партнеров ароматического взаимодействия между Nконцевым и каталитическим доменами, оказалось недостаточно для раскрытияинтерфейса, о чем свидетельствует отсутствие изменений величины Rh. В качествеобъяснения ограниченного эффекта Y614R можно предположить образование катионного взаимодействия Тyr98 с Arg614, который может быть полностьюпротонированприрН8,0.ВеличиныгидродинамическихрадиусовRh,рассчитанные на основе данных гель-фильтрации, хорошо коррелируются свеличинами Rg. В то время как структура низкого разрешения Y614R, полученная сиспользованием метода малоуглового рентгеновского рассеяния (МРР, раздел 7.2)практически не отличается от фермента дикого типа (рис.
33Г), для двойногомутанта (Y614R+Y98R) наблюдается увеличение радиуса вращения в результатераскрытия интерфейса и/или увеличения димерной фракции с 7% (фермент дикоготипа) до 27% (Y614R+Y98R мутант) (табл. 8) [259].С целью дальнейшего изучения структурных изменений, связанных с потерейароматического взаимодействия между доменами, было исследовано влияниемутации Туr98 на термостабильность фермента. r12/15-LOX достаточно стабильна вдиапазоне температур до 40°C [194], однако при более высокой температуре онабыстро теряет вторичную структуру.
На рисунках 34А и 34Б показано, чтотемпература денатурации (T50), при которой рекомбинантная r12/15-LOX теряетполовину своей вторичной структуры, в зависимости от рН находится в области 4045°С.ДлямутантовТуr98были87полученыболеесложныекривыеРис. 34. Термостабильность структуры r12/15-LOX и ее мутантов. (A и Б)Величины интенсивности сигнала КД 1 мкМ раствора липоксигеназы при 220 нмпоказана как функция температуры. (Б) Динамическое рассеяние света дляоценки агрегатного состояния r12/15-LOX и мутантов при различных pH буфера(20 мМ Tрис).денатурации.
Подобные расхождения в кинетике денатурации фермента дикоготипа и мутантов при рН 6,8 указывают на различия во вторичной структуре (КДспектров) последних при температуре 60°C. Эти данные позволяют предположитьналичие неспецифической агрегации в диапазоне высоких температур. ДляколичественнойоценкиагрегацииLOXбылоиспользованодинамическоерассеяние света, которое не показало образования высокомолекулярных агрегатовдля фермента дикого типа (рис. 34В).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
