Диссертация (1090326), страница 13
Текст из файла (страница 13)
В отличие от 16(S)-НЕТЕ, ее фторсодержащий 23а, неспособный образовыватьводородные мостики, располагался в активном центре подобно АК, о чемсвидетельствоваловведениекислородапреимущественнопоС-12прииспользовании мутанта F353L (табл. 5). Полученные данные дают возможностьпредположитьсуществованиедополнительногосвободногопространства,позволяющего модифицированному субстрату более глубоко проникать в активныйцентрферментаконформациии/илиприниматьприродногоконформацию,субстрата(АК)вкотораясоставеотличаетсяотфермент-субстратногокомплекса r12/15-LOX.5.2. Исследования r12/15-LOX с использованием ингибиторовлипоксигеназного окисления.В продолжение исследований взаимодействия r12/15-LOX с лигандом былаизучена способность соединений 49-52 и 48 ингибировать ферментативнуюактивность r12/15-LOX.
Определение концентрации ингибитора, при которой r12/15LOX теряет 50% своей активности (IC50) показало, что среди селенопроизводных69салициловой кислоты 49-52 только диселениды 49а и 51 обладали способностьюингибировать r12/15-LOX (IC50 8,6 и 5,4 мМ, соответственно). При этоммоноселениды 49 обладали более высоким сродством к 5-LOX человека (табл. 6)и наивысшей активностью по восстановлению Fe3+ (рис. 25) [238]. Z-BODTCM (48а),в противоположность соединениям 49а и 51, обладал способностью ингибироватьr12/15-LOX (IC50 0,7 мМ), сравнимой по активности с эбселеном (IC50 0,6 мМ) [228].Таблица 6.
Относительная ингибиторная активность соединений 49-52, 54 и 55Ингибитор12/15-LOXIC50 (мМ)5-LOXIC50 (мМ)эбселен (54)0,561,09салициловая49,00168,049a8,601,0149b>1000,7950с>1000,8050d>1000,6650e>1002,37515,362,0952>1004,94кислота (55)Рис 25. Восстанавливающие свойства соединений 49, 50, 54 и 55.Напротив, в случае E-изомера (48b) величина IC50 составляла лишь 21 мкМ,свидетельствуя о том, что активность Е-изомера при ингибировании r12/15-LOXпревышает активность Z-изомера в 33 раза [226]. Использование изомеровBODTCM в клеточных системах (трансфицированные r12/15-LOX моноцитычеловека)такжепоказалопреимущественноеингибирование ферментаЕ-изомером (48b), хотя различия между активностью изомеров были менее70выраженными.
На основе результатов структурного моделирования было показано,Рис 26. Структурная модель комплекса изомеров BODTCM с r12/15-LOX.что E-изомер идеально вписывается в субстрат-связывающий карман r12/15-LOX ав области его основания (Leu597) (рис. 26), а для Z-изомера существуютстерические ограничения. Это подтверждает ранее полученные результаты(разделы 2.5 и 5.2.1), которые предполагают, что остаток Leu597 может играть рольдополнительной детерминанты, ограничивающей размеры субстрат-связывающейполости фермента.71Глава 6.
Роль кислорода в реакциях с участием липоксигеназ6.1. Бифазный характер скорости окисления 19-НЕТЕ под действием r12/15LOX.Кинетика окисления АК r12/15-LOX характеризуется наличием короткой лагфазы,которуюсвязываютсокислениемвосстановленнойFe2+-формыРис.
27. Кинетика окисления 19-НЕТЕ в различных условиях Экспериментальные кривые(пунктирные линии), данные кинетического моделирования (сплошные линии). Условия: (А)100 мкM 19-НЕТЕ, 280 мкM О2; (Б) 200 мкM 19-НЕТЕ, 87 нM фермент, 1 мкM 13(S)-HpODE; (В)200 мкM 19-НЕТЕ, 280 мкM О2, 1 µM 13(S)-HpODE; (Г) 87 нM фермент, 280 мкM О2, 1 мкM13(S)-HpODE; (Д) 200 мкM 19-НЕТЕ, 280 мкM О2, 87 нM.72липоксигеназы (пероксидазной формы) в каталитически активное состояние (Fe3+)[239, 240]. Кинетика окисления терминальной 20-НЕТЕ (44с) и суб-терминальной19-НЕТЕ (44b) в отсутствии экзогенного активатора (13(S)-HpODE) характеризуетсяналичием чрезвычайно длинной лаг-фазы (~15 мин) и короткой прогрессивнойфазы, за которой следует фаза обратимой инактивации фермента (рис. 27А) [241].Наличие фазы обратимой инактивации фермента свидетельствует об образованиименее устойчивого фермент-субстратного комплекса, чем в том случае, когда АКиспользуется в качестве субстрата.
С целью выявления причин подобнойкинетическойзависимостибылипроведеныисследованияскоростиферментативной реакции в качестве функции от концентрации субстрата,кислорода, фермента, а также активатора (13(S)-HpODE). В качестве субстратабыла выбрана rac-19-НЕТЕ (44b), для которой эффект был наиболее ярковыраженным. Независимо от исходных условий (рис. 27Б–27Д) кинетическиекривые окисления rac-19-НЕТЕ имели нелинейный характер и практическиодинаковую форму. Хотя только прогрессивная фаза скорости окисления 19-НЕТЕ(рис. 27А) может быть описана уравнением Михаэлиса-Ментена, оценочноезначение величины КМ*субстрата в 90 мкМ (гипоксические условия) подтверждаетранее полученные данные о том, что наличие -4 гидроксильной группы,Рис.
28. Образование кетодиенов в процессе реакции r12/15-LOX с 19-НЕТЕ. (A)r12/15-LOX инкубировали с 19-НЕТЕ (87 нM фермент, 200 µM 19-НЕТЕ, 40 µM 13(S)HpODE, 280 µM кислород) и контролировали изменение интенсивности УФ-поглощенияпри 275 нм. (I – образец содержащий 19-НЕТЕ; II – образец не содержащий 19-НЕТЕ).(Б) Анализ продуктов реакции методом ВЭЖХ на обращенной фазе. Вставка: спектрУФ–поглощения, содержащий кетодиеновый хромофор и элюируемый со временемудерживания стандарта (13-KODE).
Методика выделения продуктов и аналитическиеусловия приведены в экспериментальной части.73независимо от ее положения, понижает сродство фермента к ПНЖК. Интересноотметить, что в случае второго липоксигеназного субстрата, кислорода, даже приего концентрации 800 мкМ насыщения не наблюдалось. В случае 19-НЕТЕ КМ(О2)превосходила более чем в 40 раз имеющееся значения КМ(О2) для комплекса АК сферментом (10-20 мкм). При более высокой концентрации активатора (13(S)HрODE) сродство фермент-субстратного комплекса к кислороду возрастало (рис.27Д), при этом увеличение концентрации кислорода ослабляло действие 13(S)HрODE (рис.
27Б). Уменьшение скорости ферментативной реакции в условияхнелимитирующихконцентрацийсубстратов(ПНЖКикислород)позволяетпредположить, что экзогенный активатор (13(S)-HpODE) может подвергатьсяферментативному превращению за счет пероксидазной активности Fe2+-LOX.Действительно, более чем через две минуты после начала реакции ~90%активатора превращались в кетодиеновое производное (рис. 28). Полученныеданные показывают, что концентрация активатора постепенно снижается впроцессе протекания реакции, при этом постоянное понижение концентрации13(S)-HpODE и уменьшение ферментативной активности сопутствуют друг другу.6.2.
Кинетическое моделирование и оценка кинетических параметров.В свете экспериментальных данных, изложенных нами, существующаякинетическая модель липоксигеназного катализа [240, 242, 243] была дополнена ирасширена с учетом ряда элементарных реакций (Схема 9): 1) Активациякаталитически неактивной Fe2+-LOX зависит от концентрации кислорода ивключает в себя образование кетодиенов и супероксид анионов. Первым шагомперекисной активации LOX является гомолитическое расщепление пероксиднойсвязи [244, 245], которое сопровождается переносом электронов от Fe2+-LOX кгидроксильному радикалу, приводя к образованию алкоксильного радикала и ОН-.Алкоксильный радикал может восстанавливать кислород с формированиемсупероксида и кетодиеновой кислоты (R=O).
Кроме того, алкоксильный радикалможет быть стабилизирован посредством бета-расщепления углеводородной цепи,эпоксидирования или димеризации. 2) В случае, когда каталитически активнаяFe3+-LOXкатализируетотщеплениеводорода,образуетсясубстрат-2+2+ферментный комплекс (EFe -S•). Введение молекулярного кислорода в (EFe -S•)приводиткобразованиюрадикальногокомплекса2+(EFe -SОО•).Обакаталитических интермедиата содержат фермент в каталитически неактивной Fe2+форме, распад которых может привести к выходу фермента из каталитическогоцикла, что, как следствие, требует его дополнительной реактивации. Выход Fe2+74формы из окислительного цикла сопровождается высвобождением радикальныхинтермедиатов (S• или SОО•).
Хотя причины выхода фермента из окислительногоцикла неясны, наиболее вероятно это связано с природой субстрата и/илинеустойчивостью фермент-субстратного комплекса. 3) Рекомбинация радикалов вактивном центре. Супероксид (О2•), образующийся при активации ферментаСхема 92+может рекомбинировать с EFe -S•. Численные значения констант скорости иобязательные параметры были получены путем валидации кинетической моделина основе экспериментальных данных.
Расчетные значения параметров приведеныв таблице 7. Полученная модель предполагает бифазный характер зависимостискорости реакции от концентрации кислорода (с компонентами высокого и низкогосродства к кислороду). Компонента с низким сродством может быть связана сучастием кислорода в повторной реактивации каталитически неактивной Fe2+2+формы, образующейся в процессе распада комплекса EFe -SОО•. Кинетическаямодель предусматривает возможность обратимой инактивации фермента (распад2+2+2+EFe -S• и EFe -SОО• комплексов).
Распад комплекса EFe -SОО• происходит с2+константой скорости k*PO=2,2 с-1, тогда как распад EFe -S• наименее вероятен(kPS=0,0009с-1).Высокаястепеньэнантиомернойспецифичностиявляетсявесомым аргументом в пользу этого предположения. Константа скорости активацииферментаподдействием13(S)-HpODE75(k+A)вдваразапревышаетТаблица 7. Параметры кинетической моделиПараметрымоделиЗначение2+Величина3+k+Aактивация фермента (EFe → EFe ) AOOH (13SHpODE)k-Aинактивация фермента (EFe → EFe ) AO• (из 13SHpODE)k+Pактивация фермента (EFe → EFe ) SOOH (15гидроперокси-19-НЕТЕ)k-Pинактивация фермента (EFe → EFe ) SO• (из 15гидроперокси-19-HETE)8,5±0,8 с-1мкM-1khотщепление водорода10,1±0,5 с-1kOвведение кислорода1,6±0,08 с-1мкM-1kPOобразование продукта (перенос электрона)28,3±2,8 с-1k*POраспад комплекса EFe -SOO•kPSраспад комплекса EFe -S•k*PSреакция комплекса EFe -S• с (O2•)1222±60,9 с-1мкM-1krреакция алкоксильного радикала RO• (AO• or SO•) с(O2•)превращение алкоксильного радикала RO• кислороднезависимым образом24·10-4±25·10-5 с-1мкM-13+2+3+3+k*r2+2,2±0,2 с-12+9·10-4±5·10-5 с-13+KPMсвязывание продукта (15-гидроперокси-19-НЕТЕ) сKAMсвязывание активатора (13S-HpODE) с EFe2+(k+P)для32·10-3±22·10-4 с-177,26±3,86 мкMсубстратное связывание (19-НЕТЕ) с EFeзначение7,0±0,4 с-1мкM-12+KSMсоответствующее122,2±12,2 с-1мкM-12+2+EFe12,8±0,97 с-1мкM-131,2±,3 мкM2+окисленной104,9±5,2 мкMформы19-НЕТЕ(15-гидроперокси-19-НЕТЕ).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
