Диссертация (1090326), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Многие виды, содержащие LOX,служат в качестве «модельных организмов», характеризующих определенныестадииразвитиямногоклеточныхэукариотов.организмов,Volvoxкоторыйcarteriявляетсясуществуетдооднимизнастоящегодревнихвремени;Trichoplax adhaerens представляет собой одного из самых простых эуметазоев(лат.Eumetazoa),родственныхкнидариям(лат.Cnidaria)[162].Другими«модельными организмами», содержащими последовательности LOX, являютсяамебаDictyostelium(образцоваяdiscoideumмодельисследованиядифференцировки клеток, хемотаксиса и апоптоза), асцидия Ciona intestinalis(считается ближайшим к человеку беспозвоночным и содержит около 80% генов40ОбщийпредшественникЦианобактерииAcaryochloris marinaCyanotece sp.Nostoc punctiformeПротеобактерииАрхеиЭукариотыБактерииЖивотныеРастенияПротистыМхиПластинчатыеTrichlopax aghaerensPhyscomitrella patensКнидарииBurkholderia thailandensisNitrosomonas europaeaPseudomonas aeruginosaShewanella woodyiPhotobacterium profundumMoxococcus xantusГрибыКрасные водорослиБазидомицетыPorphyra purpureaLaccaria bicolorЗеленые водорослиNematostella vectensis, Clavulariaviridis,Plexaura homolala, HydramagnipapillataИглокожиеStronglyocentrus purpuratusЧленистоногиеIxodes scapularisПолухордовыеSaccoglossus kowalevskiХордовыеАсцидии Ciona intestinalisГоловохордовыеBranchiostoma floridaeЛучеперные рыбы Danio rerio,Salmo salar, Takifugu rubripes,Gasterosteus aculeatusАмфибии Ambistoma mexic,Xenopus laevisРептилии Anolis carolinesisПтицы Gallus gallusМлекопитающие Tursiopstruncatus, Myotis lucifugus, Feliscatus, Macropus eugenii, Omithorhyncus anatinus, Erinaceuseuropeaus, Chgoleopus hoffmanni,Loxodonta africana,Mus musculus,Equus caballus, Sus scrofa,Oryctolagus cuniculus,Homo sapiensOstreococcus lucimarinusChlamydomonas reinhardtiiЦветковые растенияЭвдикотыGlycine maxOlea europeaeBetuta pendutaPrunus persicaVitis viniferaNicotiana tabacumArabidopsis thalianaCamellia sinensisPersea americanaPopulus trichocarpaCucumis sativusCitrus jambhiriОднопольныеOriza sativaSorghum bicolorTriticum aestivumСтраминопилыPhytophtora infestansМиксомицетыАскомицетыNeurospora crassaAspergillus fumigatusSclerotinia sclerotiorumHaematonectria haematococcaDictyostelium discoideumРис.
12. Наличие липоксигеназной последовательности в ДНК живых организмов.человека), ланцетник Branchiostoma floridae (наиболее тесно связан с первымипозвоночными), а также рыба фугу Tetraodon nigroviridis (имеет самый малый изизвестных геном позвоночных, 340 миллионов пар оснований). Danio rerio, частоиспользуемый в исследованиях развития позвоночных и изучении функции генов,содержитнесколькопоследовательностейLOX,некоторыеизкоторыхклассифицированы как 12- и 5-LOX. В геноме других модельных организмов, такихкак как Sacharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogasterпоследовательности LOX не было обнаружено.412.2.СуществуетлиобщийпрототипLOX?Заисключениемцианобактерии Acarzochloris marina, у которой было обнаружено 5 различныхпоследовательностей ДНК, кодирующих LOX, одноклеточные организмы содержат,главным образом, одну или две. Напротив, у мыши найдено 7 функциональныхгенов LOX, при этом наличие сплайсинговых вариантов увеличивает общее числоэкспрессируемых LOX.
Arabidopsis thaliana, который используется как «модельныйорганизм» высших растений, содержит 6 генов LOX [163]. У некоторых растенийнайдено более чем 15 различных последовательностей ДНК, кодирующих LOX.Сравнение последовательностей ДНК данных видов предполагает, что некоторыеиз них могли возникнуть в процессе эволюции вследствие дупликации генов [164,165]. Вопрос о существовании древнего предшественника LOX и то, какая изобнаруженных на сегодняшний день изоформ наиболее тесно связана с этойгипотетической формой, остается не выясненным.
Присутствие LOX в бактерияхпородило различного рода дискуссии о возможности горизонтального переносагенов [159]. Хотя многие из одноклеточных организмов являются патогенами илисимбионтами и, таким образом, входят в тесный контакт с растениями иживотными, количество и гетерогенность изоформ LOX в низших организмахсвидетельствует о том, что горизонтальный перенос генов, возможно, является неединственным объяснением присутствия LOX у прокариотов.
Наиболее вероятно,что как у прокариотов, так и эукариотов LOX эволюционировали исходя из общегодревнего предшественника. Цианобактерии являются одной из самых древнихформ жизни на Земле. Они, как полагают, ответственны за преобразованиедревней атмосферы Земли в окислительную среду, благодаря их способностиосуществлятьфотосинтезивысвобождатьмолекулярныйкислород.LOXвстречается в цианобактериях разного порядка [71, 72, 160, 167,168], что указываетна ранние стадии образования этих ферментов в процессе эволюции. Такимобразом, вполне возможно, что экспрессия первых генов LOX наблюдалась уцианобактерий.
Согласно эндосимбиотической теории, цианобактерии происходятот хлоропластов [169, 170]. В условиях переноса пластидных генов в ядерныйгеном [171–175], LOX могли зародиться в растениях, так как изоформы LOX изсовременныхрастенийлокализуютсявпластиднойпоследовательностимитохондриального генома. Недавно были найдены LOX и в других пластидах,включая хромопласты зрелых томатов [156]. Еще одним аспектом более позднейэволюции LOX является предположение о том, что только 12/15-LOX гоминидов(человек, шимпанзе, орангутанг или горилла) является разновидностью «истинной15-LOX».
Хотя позиционная специфичность LOX шимпанзе и гориллы неисследована досконально, сравнительный анализ последовательности белка в42области компонент триады предполагает окисление АК по 15-му положению.Напротив, у других млекопитающих, таких как Macaca mulatta, свинья, мышь икрыса наблюдается экспрессия группы изоформ 12/15-LOX [113, 177–180], длякоторых окисление субстрата по 12-му положению является предпочтительным.Единственным исключением из этого правила является кролик, у которогообнаружены гены, кодирующие как 12-, так и 15-LOX [181]. Имеет ли этот сдвиг всторону15-липоксигеназногоокисленияАКвпроцессеэволюцииLOXмлекопитающих какое-либо функциональное значение, еще предстоит изучить.2.3. Биологическая роль изоформ LOX.
Биологическая функция LOXмлекопитающих была исследована методом нокаута соответствующих генов.Мыши, у которых удален ген 12/15-LOX [182], ген 5-LOX [183] или ген 12-LOXтромбоцитарноготипа[184],являютсяжизнеспособнымиинормальноразвиваются. Подобное наблюдается и при двойном нокауте генов 12/15-LOX+5LOX [185]. В растениях LOX участвуют в многочисленных процессах, включаябиосинтез фитогормонов [166], прорастание семян [187], старение листьев [188,189] и развитие аромата [190, 191]. Однако, остается неясным, почемуопределенные представители растений экспрессируют различные изоформы LOX.В низших организмах биологическая роль LOX подробно не изучалась. В кораллахPlexaurahomomallaэтотферментучаствуетвпроцессахбиосинтезапростагландинов [191], которые составляют 2-3% от сухого веса организма. Ксожалению, биологическая роль производных простагландинов в физиологиикораллов до сих пор не изучена.
При поражении цианобактерий ультразвукомнаблюдается сдвиг в сторону увеличения образования эндогенных продуктов LOX[121]. В других низших организмах изоформы LOX могут играть важную роль взащитныхмеханизмахклетки,такихдифференцировки и созревания.43какреакциинастресс,процессахГлава 3. Будущее и перспективы развития исследований в областиструктурной биологии LOX.За последние 20 лет были получены рентгеноструктурные данные для целогоряда LOX животного и растительного происхождения (табл.
1). Эти данныепредставляют собой основу для моделирования трехмерных структур менееизученных LOX, подобно тому, как это было сделано для 5-LOX картофеля [193].Использование данного подхода представляет собой большую опасность, так какмоделирование,основанноелишьнасходствеаминокислотнойпоследовательности белка, может привести к получению ложных выводов оконструктивных деталях и функциональных особенностях в условиях отсутствияфункциональныхданных.Отличительнойчертойвобластиисследованийструктурной биологии LOX последних лет явился повторный анализ рентгеновскихкоординат, полученных в 1997 году для комплекса фермента кролика (r12/15-LOX)с ингибитором [63].
Его результаты отчетливо демонстрируют, что r12/15-LOXявляются динамическиой структурой, которая подвергаются конформационнымизменениям в процессе взаимодействия с ингибитором. Подобные структурныепертурбации довольно внушительны, так как происходят не только в областисубстрат-связывающегокармана,ноинаповерхностибелка.Так,врелаксированной форме (конформер А) компоненты триады не являются частьюсубстрат-связывающего кармана из-за помех со стороны остатка Leu597. Напротив,в закрытой структуре, содержащей лиганд (конформер Б), Leu597 смещен так, чтооткрывает дно кармана для проникновения ПНЖК в активный центр таким образом,что ее «хвост» может вступать в контакт с компонентами триады [91, 92].
Нашиисследования с использованием методов кругового дихроизма и динамическойфлуоресценциилипоксигеназойпоказывают(LOX1сои)[194],чтоструктурапосравнениюферментакроликасрастительнойявляетсяболееподвижной (рис. 13 и 14). Проявляют ли другие изоформы LOX, такие как 5-LOXчеловека или 8R-LOX кораллов, для которых получены кристаллические структуры,подобную степень структурной гибкости, остается неясным.Действительно,сравнительный анализ кристаллических структур комплекса 8R-LOX с АК и 8R-LOX,не содержащей субстрата, показывает лишь не значительные конформационныеизменения, которые претерпевает этот фермент при взаимодействии с лигандом(рис.
5Б и 5В). Другим открытым вопросом структурной биологии LOX являетсяроль N-терминального -складчатого домена. Мутагенез и ограниченный протеолизпоказали, что этот домен участвует в мембранном связывании и регулированииферментативной активности. Хотя каталитический домен LOX является структурно,4445устойчивой единицей в составе молекулы белка, не исключено, что усечение Nтерминального домена приводит к структурно-функциональным изменениям вкаталитическом домене [194]. Результаты исследований структуры r12/15-LOX врастворе, полученные с применением МРР [90], дали возможность предположитьзначительную степень структурной подвижности N-терминального домена поотношению к каталитической единице.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
