Диссертация (1090326), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Берлин,Германия.4Вработе использовались природная r-12/15LOX, выделенная из клеточной суспензиикрови кролика, обогащенной ретикулоцитами [231], а также рекомбинантные препараты(фермент дикого типа r-12/15LOX и мутанты). Рекомбинантные препараты, содержащие 6His ТАГ, получали экспрессией фермента в Escherichia coli [77], обогащением ферментныхфракций на смоле Ni-NTA (Quiagen), которые, если не оговаривается отдельно,подвергались очистке методом жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC) наанионно-обменных смолах и гель-фильтрацией. Чистота полученных препаратовсоставляла >98%.62Рис. 21.
Введение фотоаффинной метки в r12/15-LOX с использованиемазидо- производных АК. (А) Кривые окисления фотоаффинных зондов поддействием r12/15-LOX; (Б) Анализ продуктов окисления 19-азидо-ETE методомВЭЖХ на прямой фазе. (В) Введение фотоаффинной метки в r12/15-LOX наоснове [3H8]-19-азидо-ETE (47b); (Г) ВЭЖХ анализ 19-азидо-ETE; (Д)Хроматограмма пептидов протеолитического расщепления меченой r12/15LOX под действием трипсина; (E) Распределение радиоактивности пофракциям. Методика выделения продуктов и аналитические условия приведены вэкспериментальной части.условиях ковалентное связывание 0,30 нмоль меченого зонда приходилось на 1,5нмоль r12/15-LOX. Полученные данные свидетельствовали о том, что в среднем 1молекула 19-азидо-ETE (47b) связывалась с каждой пятой молекулой белка.Меченыйбелокосаждали,отмывалиотизбыткамаркера,подвергалипротеолитическому расщеплению под действием трипсина [147], после чего63пептидные фрагменты разделяли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис.21Д).
Большая часть радиоактивно меченых пептидов имела время удерживания67-73 мин, тогда как аффинный маркер (47b) - 73,5 мин (рис. 21Г). ПодобноеудерживаниецелевыхпептидныхфрагментовнаобращеннойфазеС18свидетельствовало о высокой степени их гидрофобности. Анализ меченныхпептидных фрагментовосуществлялина основе результатов аналогичныхэкспериментов с нерадиоактивной 19-азидо-ETE (46b) методом MALDI-TOF. Дляэтой цели была получена дифференциальная база данных, исключающая массыконтрольныхпептидныхфрагментовнемеченойr12/15-LOX,вкоторойпредусматривалось не только ковалентное связывание с маркером (46b), но ипродуктом его ферментативного окисления [М+18].
Анализ дифференциальнойбазы данных позволил обнаружить фрагмент Р7 с m/z 3560, который отсутствовалв контрольном массиве и был идентифицирован как пептид D571-K599 (табл. 3).Этот пептид имеет аминокислотную последовательность подвижной 18 спирали,которая своей С-концевой частью образует дно субстрат-связывающего кармана исодержит детерминанты (Ile593, Leu597) [33, 91], определяющие положение субстратав активном центре r12/15-LOX. Также, этот пептид содержит боковые цепи Leu589 иGln590, выступающие в качестве детерминант позиционной специфичности 15-LOX2человека.Таблица 3.
Анализ MALDI-TOF и определение масс пептидных фрагментовПептидАминоПоследМассаМассаЛокализациякислотыовательностьэксп.расч.(домен)Р1*2-45GVYRVCVSTGASIYAGSKNKVELWLVGQHGEVELGSCLRPTRNK5113,005111,89N-терм.Р2*2-68GVYRVCVSTGASIYARPTRNKEEEFKVNVSKYLGSLLFVRLRKK7877,057877,24N-терм.Р3*22-50VELWLVGQHGEVELGSCLRPTRNKEEEFK3733,103733,30N-терм.Р4*46-72EEEFKVNVSKYLGSLLFVRLRKKHFLK3658,683659,44N-терм.Р5*73-99EDAWFCNWISVQALGAAEDKYWFPCYR3620,043618,13N-терм.Р6139-171LYQWGSWKEGLILNVAGSKLTDLPVDERFLEDK4141,014139,82C-терм.(поверхность)Р7571-599DATLETVMATLPNLHQSSLQMSIVWQLGK3560,233559,23C- терм.*пептиды, содержащие продукт окисления 19-азидо-ETE (46b)64(акт.
центр)Рис. 22. Расположение пептидов, модифицированных фотоаффинной меткой, вструктуре r12/15-LOX.Структурное моделирование c использованием методов молекулярнойдинамики с минимизацией энергии [233] показало, что C-19 атом аналога АК (46b),несущий фотореактивную азидогруппу, расположен в непосредственной близостиотIle593вС-концевойчастипептида(рис.22А).Анализфрагментовпротеолитического расщепления позволил также обнаружить наличие пятипептидов N-терминального домена (Р1*-Р5*) с перекрывающейся аминокислотнойпоследовательностью (табл. 3, рис. 20Б), которые могут быть ковалентно связаны спродуктом окисления 46b, а также пептид Р6 (табл. 3), находящийся наповерхностикаталитическогодомена.Полученныеданныенетолькоподтверждают возможность взаимодействия терминальной части субстрата сэлементами 18 спирали, ограничивающей полость субстратного кармана, но ивпервые экспериментально подтверждают возможность участия аминокислотных65остатков, находящихся на поверхности фермента, в процессах связывания r12/15LOX с субстратом.5.1.2.ЭнантиоселективноеокислениерегиоизомеровПНЖКгидроксилированных в субтерминальной части молекулы под действиемr12/15-LOX.
В соответствии с классической моделью трехмерной структуры r12/15LOXоснованиееесубстрат-связывающегокарманаобразованотриадойаминокислотных остатков в положениях 353, 418/419 и 593, которые ограничиваютглубину проникновения АК в активный центр фермента, определяя тем самым егоРис. 23. Избирательное окисление rac-16- и 17-НЕТЕ в реакции с r12/15-LOX.Методика выделения продуктов и аналитические условия приведены вэкспериментальной части.66позиционную специфичность. В отличие от природного субстрата, АК, 16- (22), 17(33) и 18-НЕТЕ (44) содержат асимметрический центр в непосредственнойблизости от системы двойных связей, что могжет оказывать влияние навзаимодействие донора (бисаллильная СН2-группа) и акцептора водорода (Fe3+OH) в процессе ферментативной реакции. В отличие от rac-18-НЕТЕ (44), r12/15LOXокисляетrac-16-НЕТЕ (21)иrac-17-НЕТЕ (33)с ярко выраженнойэнантиоселективностью (рис.
23). В то время как 16(S)- и 17(S)-НЕТЕ являютсяотносительно хорошими субстратами фермента, их R-энантиомеры окисляютсяменее эффективно. Подобная энантиоспецифичнось наблюдалась раньше дляряда ферментов, участвующих в метаболизме липидов [235–238], однако дляr12/15-LOX показана впервые. Аминопроизводные 17-амино-ЕТЕ (40) не являлисьсубстратами r12/15-LOX. Для проведения детальных кинетических исследованийферментативной реакции в качестве субстратов были использованы 16(R)- (22а),Таблица 4. Кинетические параметры окисления ПНЖК рекомбинантной r12/15LOX и ее мутантом F353LF353L мутантWT 15-LOXСубстратkkat (с-1)KM* (µM)kkat/KM*Kэнkkat, (с-1)KM*, (µM) kkat/KM* Kэн(x10-3)АК8,16±0,253,0±0,2270016(S)-HETE0,51±0,0723,6±7,021,6(x10-3)6,02±0,918,7±2,96910,20±0,0122,7±6,98,80,08±0,02136±590,60,24±0,0931,3±12,37,614,7<30,916(R)-HETE≤0,0228,9±9,0<0,717(S)-HETE1,24±0,23236±295,21,47,417(R)-HETE0,18±0,06293±400,70,20±0,0836,8±12,85,416(S)- (22b), 17(R)- (33а), 17(S)-НЕТЕ (33b).
Сравнение kcat/KM* для двухэнантиомеров 16-НЕТЕ также показало избирательность фермента по отношению к(S)-энантиомеру (Кэн>30,9) (табл. 4). В случае 17-НЕТЕ энантиоселективность быламенее выраженной (Кэн 7,4). Полученные данные свидетельствуют об убыванииэнантимерной специфичности по мере удаления хирального атома (С-16, С-17, С18) от центра отщепления водорода (С-13).Окисление АК r12/15-LOX характеризуется наличием двойной позиционнойспецифичности введения кислорода в молекулу субстрата при С-15 и С-12 в67Таблица 5. Позиционная специфичность окисления ПНЖК r12/15-LOX и F353LмутантаСубстратWT 15-LOXпродуктАКдоля(%)F353Lпродуктдоля(%)15(S)9315(S)2812(S)712(S)7216(S)-HETE 15,16(S)9315,16(S)8912,16(S)712,16(S)1115,16(R)612,16(R)9416(R)-HETE17(S)-HETE17(R)-HETE16(S)-FETE16(R)-FETE15,17(S)8815,17(S)312,17(S)1212,17(S)9715,17(R)6315,17(R)112,17(R)3712,17(R)9915,16(S)6915,16(S)2512,16(S)3112,16(S)7515,16(R)7815,16(R)2412,16(R)2212,16(R)76соотношении примерно 10:1.
Анализ продуктов окисления 16(S)-НЕТЕ (22b)методом ВЭЖХ на прямой и обращенной фазах показал образование основного иминорного продуктов в соотношении 93:7, содержащих сопряженный диеновыйхромофор.Этисоеднениябылиидентифицированыспомощьюмасс-спектрометрии как 15,16- и 12,16-DiHETE (табл. 5), соответственно. Для 16(R)НЕТЕ (22а) было обнаружено лишь небольшое количество неспецифическихпродуктов окисления, что согласуется с данными кинетических исследований(табл. 4).
Когда 17(S)-НЕТЕ (33b) использовалась в качестве субстрата,соотношение продуктов незначительно сдвигалось в сторону 12-липоксигеназногоокисления (88:12) (табл. 5). При окислении 17(R)-НЕТЕ, напротив, доля 12(S),17(R)DiНЕТЕ возрастала до ~30%. Эти данные свидетельствовали о том, что 16(R)НЕТЕ (21а) и 17(R)-НЕТЕ (33а) могут проникать глубже в субстрат-связывающийцентр фермента, за счет чего реакционное расстояние между донором иакцептором водорода увеличивается.Замена объемного Phe353 на Leu путем ведения точечной мутации F353Lприводит к образованию дополнительного пространства в активном центре r12/15LOX, что позволяет субстрату (АК) глубже проникать в субстрат-связывающий68Рис. 24.
Субстратное связывание арахидоновой кислоты и 16(S)-НЕТЕ (21b)активном центре 15-липоксигеназкарман, или принимать альтернативную конформацию в области ее терминальнойчасти (рис. 24) [92]. В случае с 16(S)-НЕТЕ можно предположить, что наличие ОНгруппывS-положениипрепятствуетэтомупроцессу.Действительно,избирательность мутанта F353L по отношению к 16(S)-НЕТЕ сохранялась (Кэн 14,7;табл. 4). В этом случае, как и для фермента дикого типа, сдвига позиционнойспецифичности не наблюдалось. Напротив, при использовании 16(R)-НЕТЕ и обоихэнантиомеров 17-НЕТЕ окисление происходило преимущественно по С-12 (табл.5).Структурное моделирование комплексаr12/15-LOX-16(S)-НЕТЕ показаловозможность образования водородной связи между гидроксильной группойсубстрата и остатком Gln548, входящим во вторую координационную сферу Fe3+ [31,87].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
