Диссертация (1090326), страница 8
Текст из файла (страница 8)
При этом можно предположить протекание процесса инактивации потрем различным механизмам: (I) химическая модификация аминокислотныхостатков образовавшимся пероксидом [144]; (II) образование инактивирующихпромежуточных соединений и радикалов (например, алкоксильный радикал) впроцессе гиропероксидазной реакции реакции [145] и, (III) образование реактивныхпромежуточныхпродуктоввпроцессеформированияэпокси-лейкотриенов.Следует подчеркнуть, что гидропероксиды ПНЖК, содержащие бисаллильныеметиленовые группы (например, 15-HрETE и 5-HрETE) могут трансформироватьсяпод действием LOX гидропероксидазной и эпоксилейкотриен синтазной реакцииРис. 9.
ВЭЖХ (прямая фаза) продуктов окисления 15-HpETE r12/15-LOX (А) и (Б)УФ-спектры полученных продуктов. Продукт I – продукт ферментативного 12липоксигеназного окисления 15-HpETE; II и III продукты неферментативногогидролиза 14,15-LTA.(рис. 9). Напротив, гидропероксиды ПНЖК, которые не имеют бисаллильныхметиленовых групп (13(S)-HрODE) могут подвергаться дальнейшей модификацииисключительнодействиемгидропероксидазнойреакции.Обобщаявышеупомянутые возможности, можно сделать вывод о том, что не существуетединого механизма суицидальной инактивации LOX. Этот процесс, по-видимому,представляет совокупность нескольких механизмов.
Тем не менее, нельзяисключить, что при определенных экспериментальных условиях только лишь одиниз этих механизмов может доминировать.35Ранее предполагалось, что селективное окисление остатка метионина привоздействии 13(S)-HpODE на r12/15-LOX [140] может вносить вклад в инактивациюфермента. Хотя дальнейшие эксперименты и показали окисление метионина,маловероятно, что этот процесс как-либо связан с наличием суицидальнойинактивации, так как замена этой аминокислоты методами направленногомутагенеза на устойчивый к окислению аланин не уменьшала степени инактивациифермента [141]. Более поздние исследования инактивации других изоформ LOXдействием 15(S)-HрETE предположили возможность ковалентного связыванияактивных метаболитов 15(S)-HрETE со структурными элементами белка, какосновополагающего процесса, приводящего к суицидальнй инактивации [125, 146].Исследования показали [147], что ковалентное связывание метаболитов 15(S)HрETE сильно снижается при использовании фермента, инактивированногоРис.
10. (А) Структура активного центра r12/15-LOX и обнаруженныемодифицированные пептиды. (Б) Поверхностная структура r12/15-LOX иповерхностный модифицированный пептид Р16. Arg403, какк предполагают,является детерминантой связывания карбоксильной группы ПНЖК с ферментом. Заоснову данного рисунка взята иллюстрация из публикации [147] с изменениями.температурнойобработкой.Этиданныепозволяютпредположить,чтосуицидальная инактивация r12/15-LOX в процессе окисления АК протекает главнымобразом по гидропероксидазному или лейкотриенасинтазному механизмам..Анализ пептидов, полученных протеолетическим расщеплением r12/15-LOX,инактивированнойрадиоактивно-меченной15(S)-HрETE[147],позволилобнаружить меченные пептиды активного центра фермента, а так же одинковалентно модифицированный пептид поверхности белка, который содержитэлементы подвижной 2-спирали (рис.
10). Если ковалентная модификацияпептидов активных сайта приводит к необратимой инактивации фермента, то рольповерхностных элементов белка в этом процессе объяснить сложно. Для этогонеобходимо сделать допущение того, что ковалентно модифицированный пептид36находится в непосредственной пространственной близости от входа в субстратсвязывающий карман.1.14. Аллостерический характер LOX.
Относительно недавно возможностьаллостерической регуляции ферментативной активности в присутствии АТФ иионов Са2+ была показана для 5-LOX человека [148–149]. Исследования в областикинетики окисления синтетических сульфатов жирных кислот h12/15-LOX такжепоказывают возможность аллостерической регуляции активности h12/15-LOX [150],при которой активатор не является лигандом активного центра фермента.Присутствие эндогенных ферментативных продуктов липоксигеназного окисленияАКиЛК,12-НрЕТЕи/или13-НрODE,такжевлияютнакаталитическуюэффективность процесса окисления АК (kcat/KM) как в случае h12/15-LOX, так и 15LOX2 человека, увеличивая не только каталитическую эффективность окисленияАК по сравнению с ЛК [(kcat/KM) AК/(kcat/KM) ЛК], но и сродство h12/15-LOX ккислороду при окислении АК [26, 27].
Напротив, в случае окисления ЛК сродствофермента к кислороду понижается [27]. Таким образом, в клеточной системе, гдеодновременно присутствуют обе ПНЖК, присутствие аллостерических эффекторовможет изменять субстратную специфичность фермента в сторону окисления АК.Интересно отметить, что присутствие как 15-НЕТЕ, так и 13-HODE не влияет накаталитическую активность LOX1 сои [151]. Присутствие ингибиторов окисленияПНЖК, таких как сульфаты олеиновой и пальмитиновой кислот, не только понижаеткаталитическую активность LOX1, но и изменяет специфичность фермента поотношению к АК. Эти данные показывают, что как 12/15-LOX, так и LOX1 соиподвергаются аллостерическому контролю, однако молекулярный механизм этогопроцесса до настоящего времени недостаточно изучен.
Хотя нахождение центрасвязывания с аллостерическим регулятором остается неизвестным, исследования15-LOX-2 человека показывают, что аллостерический эффектор, 13-HODE, взависимости от субстрата, может являться как активатором (в случае с АК), так иингибитором (в случае с ГЛК) липоксигеназной реакции [152]. Эти результатысвидетельствуют о том, природа структурных изменений в молекуле фермента,происходящих в присутствии лиганда может лежать в основе процессоваллостерического регулирования.371.15. Структура LOX в растворе.
Данные исследований структур r12/15LOX [90] и LOX1 сои [88] методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МРР)свидетельствуют о том, что оба этих фермента в условиях низкой концентрациибелка находятся в растворе, главным образом, в виде гидратированных мономеров(<1мг/мл).Этиданныеподтверждаютсярезультатамиэлектрофорезавнеденатурирующих условиях, гель-фильтрации и масс-спектрометрии. Структуранизкого разрешения, полученная для 12-LOX тромбоцитов человека методом МРР,показывает, что этот фермент находится в водном растворе в виде димера иобладает тенденцией к агрегации в крупные олигомеры [153].
Детальноеисследование механизмов олигомеризации свидетельствует о том, что этотпроцесс происходит за счет образования межмолекулярых дисульфидных связей,неустойчивыхввосстанавливающейсреде.Напротив,димеры12-LOXтромбоцитов человека стабильны в восстанавливающей среде, что исключаетпотенциальное участие дисульфидных мостиков в процессе олигомеризации [153].Масс-спектрометрическийанализферментавводномрастворепозволяетобнаружить белок с молекулярной массой в 77 кДа, что характерно длямономерной фракции фермента (рис. 11). Подобное противоречие между даннымиРис.
11. (А) I – Расчетная модель структуры низкого разрешения r12/15-LOX врастворе, полученная на основе компиляции структур низкого разрешенияисходя из II экспериментальной модели на основе данных МРР для r12/15-LOX иIII теоретической модели МРР на основе данных кристаллической структурыr12/15-LOX [31].
(Б) Структура низкого разрешения 12-LOX тромбоцитовчеловека в растворе. За основу рисунка А взята иллюстрация из публикации [90] сизменениями. На рисунке Б представлено сопоставление структуры низкогоразрешения 12-LOX тромбоцитов (16 Å), полученных методом МРР, с игомологической моделью 12-LOX тромбоцитов на основе структуры 12/15-LOX вкристалле.38МРР и масс-спектрометрии свидетельствуют в пользу образования нековалентныхдимерных комплексов, неустойчивых в условиях проведения анализа. 5-LOXчеловека, напротив, может образовывать димеры и/или более крупные олигомерыпосредством образования межмолекулярных дисульфидных мостиков с участиемостатков Cys159, Cys300, Cys416 и Cys418.
При этом сайты связывания с АТФ находятсяв непосредственной близости от поверхности междоменного контакта [154].39Глава 2. Эволюция LOXГены,2.1.кодирующиепоследовательностьлипоксигеназ,обнаружены в эукариотах и бактериях, но не найдены в археях. Гены LOXобнаружены в растениях [155, 156], животных [1, 113], включая ряд морскихорганизмов [157, 158]. Недавно изоформы LOX были также обнаружены вразличных прокариотах [159–161]. Для получения более подробной информации обэволюцииLOXбылпроведенпоискнаосновеспецифичныхдляLOXпоследовательностей ДНК с использованием баз данных GenBank, Refseq, Uniprot,Ensembl.
Семейство LOX является структурно гетерогенной группой в силу того,что последовательности как ДНК, так и белка известных на сегодняшний деньизоформ LOX не содержат отличительных признаков, характерных для всехпредставителей семейства LOX одновременно. В качестве ключевого элементапоиска были использованы фрагменты ДНК, кодирующие непосредственныелиганды железа и их ближайшее окружение. Результаты проведенного поискасгруппированы по доменам клеточных форм жизни (рис.
12). ПоследовательностиLOX были найдены как у эукариотов, так и у прокариотов. В археях, напротив,липоксигеназы не были обнаружены, что неудивительно, принимая во вниманиеисключительную среду их обитания. Для большинства архей субстрат LOX –молекулярный кислород – является токсичным. В процессе эволюционногоразвития LOX появились у ряда прокариотов (цианобактерии и протеобактерии), впростейших одноклеточных организмах (красные и зеленые морские водоросли),амебе (Dictyostelium discoideum), грибах, растениях (мхах и цветущих растениях) иживотных (рис. 12). У животных последовательности LOX встречаются вомножестве видов, начиная с пластинчатых Trichoplax adhaerens до приматов,включая кораллы, клеща, желудевого червя, рыб, лягушек, летучую мышь, ежа,мышь, дельфина, слона, обезьяну и человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
