Диссертация (1090326), страница 4
Текст из файла (страница 4)
К сожалению,для «мини-LOX» данные о кристаллической структуре отсутствуют, что делаетанализ структурных изменений, вызванных усечением N-терминальной части,невозможным. Усечение N-терминального β-складчатого домена r12/15-LOXкролика генно-инженерными методами [77], напротив, приводит к понижениюэффективности катализа (1,43 против 0,14 мкМ/с). Интересно отметить, чтоусеченный мутант подвергается более быстрой суицидальной инактивации в17процессе окисления АК.
Эти данные свидетельствуют о том, что N-терминальный-складчатый домен может играть роль в регулировании каталитической функциифермента [77]. Обладая структурной схожестью с β-складчатым доменом липазычеловека [31, 78], N-терминальный домен LOX растений и млекопитающих такжеучаствует в процессах ассоциации LOX с липидными мембранами [79, 80].Действительно, как направленный мутагенез поверхностных остатков триптофанаN-терминального домена 8R-LOX коралла и 5-LOX [59, 81], так и усечение складчатого домена r12/15-LOX понижают способность связывания этих белков сбиологическими мембранами. При этом изолированный каталитический доменr12/15-LOX сохраняет способность вступать в мембранное взаимодействие, хотя ив меньшей степени.
Исследования в области направленного мутагенеза показали,что в этом процессе могут участвовать остатки гидрофобных аминокислот обоихдоменов,расположенныенаповерхностимолекулыбелка[77,82].Протеолитическое отщепление N-терминального -складчатого домена LOX1 сои,напротив, повышает способность фермента к мембранной ассоциации [75]. Длядостижения наивысшей каталитической активности 5-LOX человека необходимоприсутствие ионов Ca2+ [83, 84]. Хотя в присутствии Ca2+ способность r12/15-LOXкролика к мембранному связыванию повышается [82, 85], анализ поверхности складчатого домена фермента кролика не выявил наличия определенныхструктурных элементов, способных вступать во взаимодействие с ионами Ca2+.Напротив, -складчатый домен 8R-LOX кораллов содержит остатки Asp39 и Asp45, атакже Asp19, Asn44 и Glu47.
Эти аминокислотные остатки, находящиеся наповерхности белка, аналогичны соответствующим аминокислотным остаткам 5LOX человека, которые при взаимодействии с ионами Ca2+ способствуютпроникновению остатков Trp41 и Trp77 в фосфолипидный слой биомембран [59]. Таккак боковые цепи аминокислотных остатков, участвующих во взаимодействии сионамиCa2+,иостатковтриптофананаходятсянаоднойсторонеотпредполагаемого входа в субстрат-связывающий карман, они, по-видимому,изменяют конформацию каталитического домена, облегчая проникновения ПНЖКмембранной фазы в активный центр фермента.1.3.
С-Терминальный домен LOX содержит субстрат-связывающийкарман и каталитически активное негемовое железо. Каталитический доменвсех известных на сегодняшний день изоформ LOX состоит, главным образом, из-спиралей и содержит негемовое железо. Девятая спираль LOX1 сои длиной в 65Å (аминокислотные остатки (а.о.) 473–518) является центральным структурным18элементом каталитического домена [46]. Остальные из наиболее длинныхспиралейрасположеныпоотношениюкнейкакпараллельно,такиантипараллельно, образуя тем самым ядро домена в виде мультиспиральногопучка. В С-домене также представлены две антипараллельные -складки [60].
Вr12/15-LOX каталитический домен (а.о. 114–663) состоит из 21-ой спирали и малогоβ-складчатого субдомена [31]. Каталитический домен фермента кораллов (а.о.115–694) содержит 23 спирали. В этом ферменте вторая спираль разбита на двечасти и расположена под углом к тройной антипараллельной β-складке [60].Каталитически активное негемовое железо всех изоформ LOX координируется вформе октаэдрической сферы пятью аминокислотными остатками. Шестымкоординационным лигандом служит ОН-анион. В случае LOX1 сои и 8R-LOXкоралла лигандами железа являются три остатка His, один Asn и C-терминальныйIle.
В кристаллической структуре Asn отдален приблизительно на 3 Å от ионажелеза, в связи с чем его роль в образовании координационного кластерадовольно слаба. Несмотря на это, анализ рентгеновских координат [43] указываетна наличие обширной сети водородных связей между Asn и экваториальнымлигандомHis499посредствомдвухаминокислотныхостатковвторичнойкоординационной сферы железа – Gln495 и Gln697 [86].
В r12/15-LOX железокоординируется при помощи четырех остатков His и С-терминального Ile [87] (рис.2).ОдинизостатковпервичнойРис. 2. Первичная координационная сфера железа r12/15-LOXкоординационной сферы His (His545) соответствует Asn, который является лигандом19железа в LOX1 сои.
Что касается липоксигеназ растений, их координационныесилы стабилизированы при помощи сети водородных связей при участии лигандоввторичной сферы: Glu357 (соответствует Gln495 LOX1 сои) и Gln548 (соответствуетGln697 LOX1 сои) [31]. Исходя из кристаллических структур липоксигеназмлекопитающих, известных на сегодняшний день, можно заключить, что, посравнению с 5-LOX человека [63] и r12/15-LOX кролика [67], ионное окружениежелеза12-LOXлейкоцитарноготипа[65]наиболееприближенокшестикоординатной геометрии октаэдра, что предполагает более стабильнуюструктуру кластера железа.1.4. Междоменная подвижность как источник структурной гибкостиLOX.
Анализ рентгеноструктурных координат LOX1 сои предполагает,что двухдоменная организация белка является весьма устойчивой.Сравнительно большая поверхность междоменного контакта (2600 Å2) [46]предполагает сильное нековалентное взаимодействие между доменами, чтоограничивает подвижность N-терминального -складчатого домена по отношению ккаталитическойсубъединице.Такимобразом,-складчатыйдоменможетнезначительно перемещаться вдоль поверхности контакта с каталитическимдоменом,однакоегодвижениеперпендикулярноплоскостиповерхностималовероятно [88]. Это предположение подтверждается данными, полученными спомощью малоуглового рентгеновского рассеяния (МРР) – метода, которыйпозволяет характеризовать структуры белков в растворе.
Сопоставление структурLOX1 сои в растворе и в кристалле показывает, что N-терминальный -складчатыйдомен находится вблизи каталитического домена [88, 89]. r12/15-LOX, напротив,обладает высокой степенью структурной подвижности, так как имеет меньшуюповерхность междоменного контакта по сравнению с LOX1 сои (1600 Å2).Сравнение структуры r12/15-LOX в растворе в отсутствие лиганда (данные МРР,концентрация белка < 1 мг/мл) со структурой в кристалле показывает почтиидеальное соответствие в области каталитического домена [90]. В то же время вобласти N-терминального β-складчатого домена были обнаружены значительныерасхождения.
На основе этих данных можно предположить, что N-терминальный складчатый домен может довольно свободно перемещаться по отношению ккаталитической единицe.1.5. Связывание лиганда с активным центром r12/15-LOX приводит кконформационным изменениям белковой матрицы. В отсутствие лиганда входв предполагаемый субстрат-связывающий карман r12/15-LOX кролика имеет форму20воронки и обеспечивает прямой доступ субстрата к каталитически активномужелезу. В случае, когда молекула белка содержит лиганд, фермент принимает такназываемуюзакрытуюконформацию,вкоторой2спиральсмещаетсяприблизительно на 12 Å (рис. 3А) по отношению к исходному положению, блокируявход в субстрат-связывающий карман [56]. Этот процесс сопровождаетсяконформационными изменениями в активном центре, в соответствии с которымиспираль18,ограничивающаядносубстрат-связывающегокармана,разворачивается, увеличивая его объем.
Подобная трансформация являетсявесьма существенной, так как α-атомы углерода в Leu597 в обоих конформерахудаляются друг от друга на расстояние 6 Å [56] (рис. 3Б). СравнениеРис. 3. Сравнение структур r12/15-LOX, свободной от лиганда (конформер А) исодержащей лиганд (конформер Б): (А) в результате взаимодействия фермента слигандом 2-спираль r12/15-LOX (2-А) перемещается на 12 Å (2-В); (Б) структурасубстрат-связывающего кармана, содержащего ингибитор RS7. Субстратсвязывающая полость увеличивается в объеме за счет перемещения Leu597 на 6 Å врезультате взаимодействия фермента с лигандом.
Аминокислотные остатки Phe353,Ile418 и Ile593 представляют собой триаду детерминант позиционной специфичностифермента [91, 92].пространственныхкоординатспиралей2вдвухформахr12/15-LOXссоответствующим структурным элементом 8R-LOX коралла показывает, что дваконформераферментакроликапредставляютсобойпротивоположныепредельные структуры, в то время как 8R-LOX – промежуточное состояние [56].Подобные конформационные изменения маловероятны во многих растительныхLOX вследствие более компактной упаковки белка. В случае LOX3 сои21Рис. 4. Сопоставление структуры 2-спирали r12/15-LOX в конформере А исоответствующих ей структурных элементов других липоксигеназ (12-LOXлейкоцитов свиньи, 5-LOX человека, 8R-LOX Plexaura homomalla и 11R-LOXGersemia fruticosa).аминокислотный сегмент между Leu331 и Gln341, образующий спираль 4, слегкасмещен после проникновения лиганда, но это отклонение не превышает величинув 3 Å.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
