Диссертация (1090326), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Сравнение структур r12/15-LOX и 12-LOX лейкоцитов свиньи [65]обнаруживает значительную схожесть структурных элементов обеих липоксигеназв области 2-спирали, тогда как у Ca2+-зависимых 5-LOX человека и 11R-LOX [64]соответствующий структурный элемент представлен в виде нескольких отдельныхсегментов [63] (рис. 4).1.6.Субстрат-связывающийкарманLOXявляетсягидрофобнойполостью с выходом на поверхность белка.
Липофильный характер молекулжирныхкислот,связывающийприродныхкармансубстратовобразованLOX,предполагает,преимущественночтосубстрат-гидрофобнымиаминокислотными остатками. Отсутствие данных рентгеноструктурного анализакомплексов LOX с их природными субстратами (ПНЖК) создают трудности визучении механизмов фермент-субстратного связывания. Рентгеновские данные,характеризующиекомплексLOX3соиспродуктом13(S)-HpODE(13(S)-гидроперокси-(9Z,12Z)-октадекадиеновая кислота) [51], не могут быть использованыдля интерпретации и моделирования процессов ферментного связывания ссубстратом, так как они могут не отражать структуру каталитически продуктивногоферментного комплекса.
LOX1 сои содержит две основные полости (полость I и II),которые пересекаются друг с другом в области негемового железа [45]. Боковыецепи Arg707 и Val354 разделяют полость II, которая зажата между двумя слоямиспиралей (9, 11 с одной стороны и 2, 6, 18, 21 с другой), на две подполостиIIа и IIb. Полость IIa, которая предположительно выполняет роль субстратсвязывающего кармана, пересекается боковым каналом между аминокислотамиIle553 и Trp500, который, как полагают, служит каналом транспорта кислорода вактивный центр (рис. 5).
На основании исследований LOX1 сои с помощью22точечного мутагенеза была выдвинута гипотеза, предполагающая участие остаткаIle553 в ограничении транспорта кислорода [93]. Другие экспериментальные данные,напротив, свидетельствуют лишь в пользу влияния этого остатка на положение иконформацию молекулы ПНЖК в активном центре [42]. Роль полости IIa в процессахсубстратного связывания до настоящего времени остается предметом обсуждений.Для проникновения молекулы ПНЖК внутрь активного центра фермента необходимапереориентация боковых цепей Trp259 и Leu541 (рис. 5) [46]. Так, для ряда изоформLOX сои (LOX1, LOX3, VLX-B и VLX-D) были обнаружены различия в форме иобъеме полости IIa вследствие разной полярности, размера и химической природыа.о., образующих вход в карман [49]. В то время как полость IIa в LOX1Рис.
5. Схематическое изображение субстрат-связывающихразличных LOX и положение ключевых аминокислотныхкармановостатков,ограничивающих его полость. Проекция, представленная на рисунке, полученаналожением структур с использованием программы VMD.23соиявляетсянепрерывнымканалом,аналогичныеструктурныеэлементы,присутствующие в других изоформах LOX сои, имеют барьеры, ограничивающиепроникновение субстрата [49].r12/15-LOX является первым природным (не модифицированным генноинженерными методами) ферментом млекопитающих, для которого трехмернаяструктура была получена в виде комплекса с ингибитором (RS7) [31]. В исходнойкарте распределения электронной плотности несколько структурных элементовбелка оставались не разрешенными. Повторный анализ исходных рентгеновскихкоординат [56] позволил выявить наличие смеси двух различных конформеровLOX, один из которых присутствовал в виде комплекса с лигандом, а второй несодержал лиганда.
Сопоставление обеих структур свидетельствует о значительнойструктурноймодификации,которойподвергаетсяферментвпроцессепроникновения лиганда в активный центр (см. рис. 3). В форме, свободной отлиганда (конформер А), предполагаемая полость субстратного кармана имеетформу воронки с выходом на поверхность белка около остатка Arg403. В другойформе, содержащей лиганд (конформер Б), субстрат-связывающий карманявляется более глубоким и изогнутым за счет боковой цепи Leu408 (см. рис. 5).Стенкикарманаобразованыбоковымицепями23-хпреимущественногидрофобных аминокислотных остатков шести различных спиралей (2, 7, 9,10, 16 и 18) и петли, соединяющей 9 и 10. Вход в субстрат-связывающийкарман в этой конформации оказывается закрытым.
Кроме того, остаток Leu597восемнадцатой спирали (18) контролирует глубину полости (рис. 3Б и 5). Вконформере А боковая цепь Leu597 образует дно кармана, ограничивая такимобразом его глубину и объем. В процессе присоединения лиганда, спираль 18перемещается примерно на 6 Å по отношению к ее исходному положению, врезультате чего внутреннее пространство связывающего кармана становитсясвободным для доступа субстрата. К сожалению, функциональная роль остатковLeu408иLeu597впроцессеокисленияПНЖКнебылаисследованаэкспериментально.Свободная от лиганда 8R-LOX коралла содержит две внутренние полости,формирующие U-образный канал, который обеспечивает доступ субстрата кнегемовому железу с противоположных сторон поверхности белка (рис.
5). Дляобразования непрерывного канала необходимо изменение положения ротамераLeu386 и сдвиг остатка Leu628 [56,59] при одновременном вращении плоскостиароматического кольца Tyr179. Leu628 в 8R-LOX кораллов, который соответствуетLeu597 в r12/15-LOX, разделяет канал на две смежные подполости. Положительно24Рис. 6.
(А) Структура комплекса 8R-LOX с АК. (Б) Сравнение структур 8R-LOX,свободной от лиганда (обозначена лиловым цветом) и содержащей лиганд(обозначена зеленым цветом). Остаток Leu628 в 8R-LOX кораллов, которыйсоответствует Leu597 в r12/15LOX кролика, при связывании с АК практически неизменяет своего положения. (В) Сравнение структур 8R-LOX, свободной отлиганда (обозначена лиловым цветом), r12/15-LOX с лигандом (конформер Б)(обозначена коричневым цветом) и r12/15-LOX свободной от лигана (конформерА, обозначена серым цветом).
В результате взаимодействия фермента с лигандом2-спираль r12/15-LOX кролика (2-А) перемещается на 12 Å (2-В), тогда каканалогичный структурный элемент 8R-LOX кораллов занимает некое промежуточноеположение.25заряженные остатки Arg расположены на входе и выходе U-образного туннеля(Arg183 и Arg429) и могут взаимодействовать с карбоксильной группой жирнойкислоты во время ее проникновения в активный центр. Arg429 образует солевоймостик с остатком Glu394, закрывая вход для субстрата с одной стороны. Напротив,противоположныйвходвблизиArg183всоответствииспозиционнойспецифичностью этой изоформы, скорее всего, является функциональным.
Этопредположение подтверждается данными ретргено-структурного анализа 8R-LOX сАК (рис. 6А) [61]. Хотя структура 8R-LOX (PDB: 4QWT) и представляет собойтетрамер, только одна молекула фермента содержит субстрат. Сравнительныйанализ кристаллических структур 8R-LOX в комплексе с АК и молекул 8R-LOX, несодержащих субстрат, показывает, что в отличие от r12/15-LOX, этот ферментпретерпеваетлишьнезначительныеконформационныеизмененияпривзаимодействии с лигандом (рис. 6Б и В).1.7.
Молекулярный кислород проникает в активный центр LOXпосредствомстрогодиоксигеназы,LOXконтролируемыхкатализируютмеханизмов.бимолекулярныеКакреакции,идругиеиспользуяатмосферный кислород в качестве субстрата. В течение долго времени считалось,что кислород может свободно диффундировать в молекуле белка. Последниеданные, однако, указывают наличие асимметричного распределения концентрацииэтого газа в молекуле белка.
Так, для LOX 1 сои была впервые выдвинута гипотезао наличии особых каналов транспорта кислорода [94-96]. Предполагаемыйсубстрат-связывающий карман LOX1 сои (полость IIa) пересекается с боковымканалом, который граничит с Ile553 и выходит на поверхность белка в области Arg203[46](рис.5).Структурноемоделированиекомплексафермент–субстратпоказывает, что пространство в области Ile553 может быть занято субстратом – ЛК,в которой в процессе реакции отщепления водорода образуется радикал при С13.Таким образом, если эта полость выполняла бы роль потенциального канала длядиффузии, молекулы кислорода непосредственно направились бы из раствора вреакционный сайт каталитического домена. При замене Ile553 на более объемныйостаток Phe наблюдалось 20-кратное понижение эффективности окислениясубстрата [93].
Ile553 LOX сои соответствует Val439 8R-LOX коралла [60]. Этотаминокислотный остаток расположен в С-концевой части «арки», котораяограничивает полость U-образного субстрат-связывающего канала. Хотя участок Uобразной полости в области Arg429, как предполагалось изначально, играет рольальтернативногоканаласвязыванияжирнойкислотывактивномцентре,возможность того, что он может функционировать одновременно в качестве канала26для доступа кислорода, не исключена. Анализ кристаллической структурыr12/15LOX кролика показывает, что канал доступа кислорода, постулированный дляLOX сои [97], в этом ферменте отсутствует. К началу данной работы какие-либоисследования в области целенаправленного транспорта кислорода в активныйцентр r12/15-LOX не проводились.1.8.
Первичная структура LOX играет ключевую роль в реакционнойспецифичности окисления жирных кислот. Реакционная специфичность LOXпо отношению к взаимодействию с ПНЖК лежит в основе традиционнойноменклатуры LOX. Для LOX млекопитающих АК используется в качествеобразцового субстрата, тогда как LOX растений обычно классифицируютсясогласно их специфичности по отношению к ЛК. Хотя молекулярные основыреакционнойспецифичностиразличныхLOXинтенсивноисследовалисьвпрошлом, основополагающие принципы, объединяющие все липоксигеназы, невыявленыдонастоящего«микромолекулярные»времени.структурысПНЖКвысокойпредставляютстепеньюсобойгибкиеконформационнойподвижности углероводородной цепи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
