Диссертация (1090326), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Экспериментальныеданные последних лет свидетельствуют о том, что как линолевая кислота (ЛК), таки ее продукт, 13(S)-H(p)ODE, приводит 12/15-LOX в каталитически компетентноесостояние, повышая сродство фермента к другому природному субстрату,арахидоновой кислоте (АК) [26, 27]. Хотя механизмы этого процесса остаются6невыясненными, он может играть ключевую роль в клеточной биологии раковыхзаболеваний, так как первичные продукты окисления ЛК и АК изоформами 12/15LOX, 13(S)-H(p)ODE и 15(S)-H(p)ЕТE, соответственно, оказывают диаметральнопротивоположное действие на процессы пролиферации и дифференциациираковых клеток посредством как активации (13(S)-H(p)ODE) [28-29], так иинактивации (15(S)-H(p)ЕТE) механизмов МАП-киназного сигнального пути [30].Таким образом, хотя биологическая роль большинства изоформ 12- и 15-LOXмлекопитающих достаточно хорошо изучена, многолетние усилия в областиструктурно-функциональных исследований этой группы ферментов до настоящеговремени не увенчались полноценным успехом.
Главной причиной подобных неудачможет служить тот факт, что большинство гипотез и стратегий в областиисследований 12/15-LOX основывались на данных статической кристаллическойструктуры комплекса 12/15-LOX кролика (r12/15-LOX) с лигандом активного центра[31], не уделяя при этом должного внимания динамике внутри- и межмолекулярнойорганизации фермента в физиологической среде.ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯЦель настоящей работы заключалась в создании концептуально новойструктурно-кинетической модели, в основу которой положен динамическийхарактер взаимодействия этого фермента, как с субстратом ПНЖК, так и со вторым«неявным лигандом» - кислородом - в условиях конформационной подвижностибелковойматрицыкакключевогоэлемента,определяющеговзаимосвязьструктура-функция. В качестве объекта исследования была выбрана 12/15-LOXкролика (r12/15-LOX), фермент, который по своим структурно-каталитическимсвойствам наиболее близок к 12/15-LOX человека (h12/15-LOX). Для достиженияпоставленной цели, в первую очередь, было необходимо охарактеризоватьструктурные элементы белка, вступающие в непосредственное взаимодействие ссубстратом в физиологической среде.
Для этого, на начальном этапе исследованийпредстояло предложить дизайн и разработать синтез зондов активного центрафермента,наиболееблизкоотражающихструктуруприродныхсубстратов/лигандов LOX и способных вступать в ковалентное связывание сферментом, а также оптимизировать технологию введения метки в молекулуr12/15-LOX. После этого предстояло более детально изучить роль второголипоксигеназного субстрата, молекулярного кислорода, в ферментативной реакцииr12/15-LOXимеханизмыеготранспортавактивныйцентрфермента.Обобщающим звеном в рамках поставленных задач явились исследования в7области внутри- и межмолекулярной организации r12/15-LOX в водном растворе, втом числе, в присутствии лианда.НАУЧНАЯ НОВИЗНАС целью создания новой структурно-кинетической (динамической) моделилипоксигеназогокатализапредложенамеждисциплинарнаяплатформа,сочетающая в себе разработку синтетических подходов к получению аналоговприродных лигандов r12/15-LOX, математическое и кинетическое моделирование,методы биохимии и молекулярной биологии, а также структурные исследованиямакромолекул в растворе:-Предложен дизайн и разработана стратегия полного химического синтезазондов активного центра LOX на основе новых региоизомерных аналоговарахидоновой кислоты, содержащих азидогруппу в качестве фотоаффиннойметки.-Сиспользованиемполученныхсоединенийизученымеханизмывзаимодействия в ряду фермент–субстрат и впервые показана возможностьнепосредственного участия кислорода в процессах активации r12/15-LOX.-На основе компьютерного моделирования молекулярной динамики с участиеммалыхмолекулсозданаэкспериментальноподтвержденнаямодель,описывающая механизмы транспорта кислорода в белковой матрице r12/15LOX.-Впервыемутагенеза,сприменениеммалоугловогокомбинированнойрентгеновскогостратегиирассеяниянаправленного(МРР),круговогодихроизма и динамической флуоресценции проведено детальное изучениевнутри- и межмолекулярной организации r12/15-LOX в растворе.-Впервые показана возможность динамического равновесия мономер-димермеждумолекуламиr12/15-LOX,иобразованияпереходногодимерногокомплекса этого фермента в присутствии лиганда в растворе.
Полученныеданные позволяют предположить, что в переходном димере r12/15-LOX обемолекулы фермента могут работать совместно, контролируя и координируяпроцессы связывания с субстратом и диссоциации продукта.8ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ-Полученные результаты являются основой для формирования стратегии поискановых потенциальных антиатеросклеротических и противовоспалительныхлекарственных препаратов.-Предложенная междисциплинарная платформа может быть применена приизучении организации и функционирования биологических макромолекул врастворе.-Разработанные теоретические подходы для оценки энергии распределения идинамики диффузии кислорода могут быть использованы для изученияраспределения других малых гидрофобных молекул, таких как NO, CO, CO2 вструктуре макромолекул.-Разработаннаястратегиясинтезаприродных(-4)-гидроксилированныхпроизводных арахидоновой кислоты через ацетиленовые предшественникиобеспечивает возможность выхода к целому ряду новых перспективных, в томчислемеченыхтритиемсоединений,ивозможностиреализациикомбинаторного подхода при их получении.АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИОсновные результаты диссертационной работы были представлены на 18всероссийских и международных и конференциях, в том числе на III съездеБиохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); International symposium onrecent biomedical advances in eicosanoid research (Берлин, Германия, 2002); XVIIМенделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); 8thInternational conference on eicosanoids and other bioactive lipids in cancer,inflammation and related diseases (Чикаго, США, 2003); International prestigiousresearch meeting Центрального технологического университета (Блюмфонтейн,ЮАР, 2006); на ежегодном симпозиуме Европейского консорциума в областиисследований эйкозаноидов «Annual EICOSANOX Meeting 2007» (Айген, Австрия);10th International conference on bioactive lipids in cancer, inflammation and relateddiseases (Монреаль, Канада, 2007); на итоговом симпозиуме Европейскогоконсорциума в области исследований эйкозаноидов «EICOSANOX Meeting 2009» вКаролинском институте (Стокгольм, Швеция), на конференциях XVII Lipid meeting(Лейпциг, Германия, 2011) и 14th International conference on bioactive lipids in cancer,inflammation and related diseases» (Будапешт, Венгрия, 2015).
Лично автором9представлено 4 устных доклада и 7 стендовых докладов. Данные, полученные вработе, изложены в 22 оригинальных статьях и 4 обзорах в рецензируемыхжурналах из списка ВАК. Многие публикации имеют высокие индексы цитирования.ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРААвтору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования оттеоретическогообоснованиягипотез и постановки задачи,организации ипланировании проведения ключевых экспериментов до обсуждения и оформленияполученных результатов.
Кроме того, автором непосредственно выполненоподавляющееколичествосинтетических,молекулярнобиологических,биохимических и аналитических работ. Выводы работы базируются на данных,полученных автором лично или при его непосредственном участии (в том числесотрудниками под его руководством) в результате совместных исследований ссоавторами научных работ, перечисленных в списке публикаций автора по темедиссертации.
В диссертации частично использованы идеи и/или разработки,принадлежащие проф. Х. Кюну (Берлин, Германия), проф. Е. Скржыпчак-Янкун(Толедо, США), проф. Г. Мею (Рим, Италия) и их сотрудникам, опубликованные всоавторстве с ними. Основные статьи по работе подготовлены лично автором илипри его непосредственном участии.ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫРабота выполнена на кафедре химии и технологии биологически активныхсоединений им. Н.А.
Преображенского (ХТБАС) Института тонких химическихтехнологий ФГБОУ ВО Московский технологический университет. Части даннойработы выполнялись в рамках проведения совместных научных исследованийкафедры ХТБАС с Институтом биохимии медицинского университета Charité(Берлин, Германия). Введение радиоактивной метки проводили в Институтемолекулярной генетики РАН с участием д.х.н. В.
П. Шевченко. Кинетическое иструктурное моделирование проведено в Институте биохимии Медицинскогоуниверситета Charité совместно с группой Биофизики под руководством проф. Х. Г.Хольцхюттера (Берлин, Германия). Исследования структуры растворов белковметодом МРР поведены на разгонном кольце DORIS немецкого синхротронасовместно с группой д.х.н. Д.И. Свергуна, Европейская лаборатория молекулярнойбиологии (Гамбург, Германия). Строение всех полученных впервые соединенийоднозначно подтверждено методами спектроскопии ЯМР10Н и113C и частичнодвумернойкорреляционнойспектроскопии(HМBC/HMQC),атакжемасс-спектрометрией.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
