Диссертация (1090326), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Таким образом, конформацию, которую онипринимают в процессе связывания с активным центром, предсказать трудно.Эксперименты с изомерами синтетических ПНЖК показывают, что для LOX1 сои[98]и r12/15-LOX[99]расстояние,накоторомнаходитсябис-аллильнаяметиленовая группа, служащая донором водорода, от метильного конца субстратаимеет большое значение. Основываясь на ранних исследованиях LOX сои, быларазработана топологическая модель процесса связывания молекул субстрата(ПНЖК) с активным центром фермента [100], согласно которой метильный конецсубстрата проникает в гидрофобный субстрат-связывающий карман (модель«хвостом вперед»). При этом pro-S-атом водорода при С13-атоме углерода вмолекуле ПНЖК находится в непосредственной близости от гидроксигруппы,связанной с негемовым железом (акцептором водорода).
Связывание молекулысвободной жирной кислоты с активным центром фермента контролируетсяпосредством гидрофобного, π-электронного и ионного типов взаимодействия (рис.7).Модифицированныесубстраты,5Z,8Z,11Z,13Е-эйкозатетраеноваятакиекислота)какили15(S)-HETEее(15(S)-гидрокси-метиловыйэфир,могутсвязываться с ферментом в противоположной ориентации таким образом, чтокарбоксильная группа ПНЖК проникает в субстрат-связывающий карман. Однако,подобная ориентация субстрата «головой вперед», как правило, требует наличияположительно заряженного аминокислотного остатка в гидрофобном окружениисубстрат-связывающего кармана [101,102].27Рис.
7. Расположение молекулы ПНЖК в активном центре 12/15-LOX и движущиесилы фермент-субстратного связыванияРентгеноструктурные данные комплекса LOX3 сои с 13(S)-HpODE [51] показываютпринципиальную возможность присоединения субстрата «головой вперед», прикотором карбоксильная группа является лигандом положительно заряженногоостатка Arg726. В большинстве LOX растительного происхождения этот аргининзаконсервирован,тогдакаквферментахмлекопитающихнаегоместеприсутствуют незаряженные аминокислотные остатки. С помощью исследований вобластимутагенеза13S-LOXогурцабылиполученыдополнительныедоказательства функциональной роли Arg726 [103]. Подытоживая результатыпроведенных исследований, оба варианта субстратного связывания как «хвостомвперед», так и «головой вперед» представляются возможными.
В случае 13S-LOXогурца, по-видимому, существует равновесие между процессами связывания«хвостом вперед» и «головой вперед», которое определяется как природойсубстрата, так и условиями реакции [104–106]. Недавно был предложенальтернативный сценарий связывания субстрата с активным центром 8R-LOXкораллов. Для этого фермента был описан U-образный субстрат-связывающийкарман, который выходит на поверхность белка обоими концами [60] (см. рис. 5).Предполагалось, что ПНЖК могут проникать в активный центр «хвостом вперед»,используя один из двух входов. Однако, анализ кристаллической структурыкомплекса 8R-LOX кораллов с АК подтверждает функциональную роль лишьодного входа, находящегося вблизи Arg183 (рис.
6). [61]1.9.Антароповерхностныйлипоксигеназнойметиленовойреакции.группыихарактерОтщеплениевведениеатомакислорода28вистереоконтрольводородарадикалбис-аллильнойжирнойкислотыпредставляют собой две последовательные стадии катализа LOX (см. схему 1).Эти процессы происходят с противоположных сторон плоскости пентадиеновогорадикала, в котором электрон делокализован в системе двух двойных связей [35,107] (рис. 8). Подобная антароповерхностная стереохимия предполагает, чтоотщепление водорода и присоединение кислорода взаимосвязаны друг с другом.АнализаминокислотныхпоследовательностейLOXуказываетнато,чтобольшинство S-липоксигеназ содержит остаток аланина в положении 404(нумерация r12/15-LOX), тогда как в R-липоксигеназах вместо Ala присутствует Gly[33, 108, 109]. Замена Gly428 в 8R-LOX коралла на Ala с помощью точечногомутагенеза приводит к образованию основного продукта окисления (12-HpETE)преимущественносS-конфигурациейасимметрическогоцентра.Подобныенаблюдения были сделаны для 12R-LOX человека [108] и мыши [107], однако дляфермента мыши доля продукта окисления в S-конфигурации (8(S)-HpETE)составляла только 40% [107].
При использовании обратной стратегии (замена Ala416на Gly) в применении к 15S-LOX2 человека основным продуктом реакции (70%)являлась11(R)-HpETE. Частичные изменения в энантиоселективности такженаблюдались в случае введения аналогичной мутации в 8S-LOX мыши [108], LOX1сои [110], LOX Arabidopsis thaliana и LOX томатов [89]. На примере r12/15-LOXнаблюдалисьлишьчастичныеизменениявреакционнойспецифичности.Фактически, главным продуктом окисления АК мутантом A404G оставалась 15(S)HpETE, тогда как на 11(R)-HpETE приходилось не более 20% от доли общегопродукта. Для объяснения полученных данных была предложена механистическаямодель [60], предполагающая наличие пространственных затруднений привзаимодействии кислорода с радикалом ПНЖК. В случае отщепления pro-S-атомаводорода при С13-атоме молекулы АК, антароповерхностный характер реакцииLOX не допускает введения кислорода в 15R- и 11S-положения (рис.
8). Напротив,кислород может быть введен в равноудаленные 15S- или 11R-положения спротивоположных сторон молекулы ПНЖК. Боковая цепь Ala в 15S-LOX экранирует11R-положение, способствуя тем самым 15S-окислению. В случае замены Alа наменьший по размеру Gly, это препятствие исчезает. К сожалению, данная гипотезане объясняет, почему замена Ala на Gly понижает долю продуктов 15S-окисления.Вкачествевозможногообъяснениябыловыдвинутопредположениеобэкранировании кислорода как в 12S-, так и в 8R-положениях в зависимости отпространственной ориентации боковой цепи остатка Leu432 8R-LOX кораллов (рис.8) [60].
В ферменте дикого типа боковая цепь Leu432 блокирует только 12Sположение.ПризаменеGly42829наAla,метильнаягруппаРис. 8. Стереохимия липоксигеназной реакции. Pro-S-водород при C13-атомеуглерода субстрата находится перед плоскостью пентадиеновой системы. При егоотщеплении введение кислорода происходит с противоположной стороны либо в[+2]-положении с образованием 15(S)-HpETE, либо [-2]-положении, приводя кобразованию 11(R)-HpETE (верхняя панель). В случае как 15(S)-HpETE, так и 11(R)HpETE кислород вводится в молекулу субстрата с одной и той же стороны. Различияв конфигурации хиральной группы определяется изменением старшинства лигандовпри асимметрическом центре. Аналогичным образом происходит образование 8(R)- и12(S)-липоксигеназных продуктов (нижняя панель).Ala сдвигает боковую цепь Leu432 таким образом, что 8R-положение становитсязатрудненным, при этом стерические препятствия для 12S-окисления исчезают.Для подтверждения этой гипотезы Leu432 8R-LOX коралла замещали как наменьший по размеру Ala, так и на более объемный Phe [60].
К сожалению,полученные мутанты обладали довольно низкой каталитической активностью,создавая трудности при интерпретации полученных результатов. Боковая цепьLeu432 играет важную роль в позиционировании молекулы ПНЖК в активномцентре,чтоделаетневозможнымопределить,какойиздвухэффектов(расположение ПНЖК или экранирование кислорода) доминирует. Принципиальнаяпроблема данной рабочей гипотезы заключается в том, что замена Ala на Gly непредоставляет дополнительного свободного пространства. Фактически, объем Вандер-Ваальса одной отдельно взятой молекулы кислорода составляет 50 Å3, тогдакак на одну метильную группу (различие между Ala и Gly) приходится около 20 Å3.Можно также предположить, что если Ala препятствует доступу кислорода, егозамена на Gly обеспечивает беспрепятственное проникновение молекул кислородав реакционный центр.
Благодаря наличию структуры высокого разрешения 8R-LOX30кораллов, расчеты внутримолекулярного распределения кислорода [95] могли быстать подходящим методом для косвенного подтверждения этой гипотезы.Предпочтение одного положения для введения кислорода перед другим могло быбыть связано с пространственным искажением плоской части пентадиеновогорадикала и смещением электронной плотности в сторону одного определенногоатома углерода. К сожалению, непосредственные экспериментальные данные,свидетельствующие в пользу подобной делокализации электронной плотности впроцессе LOX реакции, отсутствуют.
Для LOX1 сои, которая окисляет ЛКисключительно с образованием 13(S)-HpODE, замена Ala542 на Gly приводит кобразованию приблизительно 40% 9(R)-HpODE. Фермент дикого типа и мутантA542G отщепляют один и тот же атом водорода, при этом ПНЖК находится всубстрат-связывающем центре фермента в одной и той же ориентации [105]. Таккак в обоих случаях кислород вводится в молекулу субстрата с одной стороны ееплоскости, различия в структуре продуктов являются простым результатоминверсии перераспределения радикальной плотности со сдвигом [+2] дляфермента дикого типа и [-2] для мутанта A542G (рис. 7) и, как следствие,изменения приоритетности заместителей при асимметрическом атоме углерода, ане инверсии ориентации субстрата в активном центре.1.10.Геометриятрехключевыхаминокислотопределяетпозиционную специфичность 12/15-липоксигеназ (концепция триады).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
