Диссертация (1090326), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Однако, в силу того, что LOX традиционносчитались мономерными ферментами, возможность олигомеризации [196] неучитывалась при обработке первичных экспериментальных данных МРР [90]. Ещеодним открытым вопросом являются аллостерические свойства 12/15-LOX,которые не могут быть объяснены в рамках общепринятой модели единственногосубстрат-связывающегоальтернативныхвозможностицентрамеханизмовобразованияферментавзаимодействияпереходныхиспредусматриваютлигандом,комплексови/илиненаличиеисключаякооперативностидействия молекулярных образований в процессе катализа [197–202].
Такимобразом,вобластиструктурнойбиологииLOXостаетсямножествонеразрешенных проблем и открытых вопросов, для решения которых необходимосоздание новых комплексных подходов по изучению динамики структурных иконформационных изменений изоформ LOX в биологической среде.46Глава 4. Химический синтез зондов активного центра липоксигеназ4.1.
Полный химический синтез терминальных и субтерминальныхзамещенных производных арахидоновой кислотыСоединения, содержащие азидоугруппу в своей структуре, являются ценныминструментом при изучении взаимодействия в ряду фермент-лиганд благодаря ихспособности вступать в ковалентное взаимодействие с белком под действиемультрафиолетового облучения [203, 204]. С целью изучения процессов ферментсубстратного связывания r12/15-LOX предложена группа новых синтетическихазидосодержащих фотоаффинных маркеров липоксигеназ, которые наиболееблизко отображают структуру природного субстрата – АК, целенаправленномодифицированной в области сигнальных участков субстратного связывания(концевой CH3 группы). В основу их синтеза положено использование природныхгидроксилированных по -1-4 положению метаболитов АК.
Наличие ОН-группы вуглеводородной цепи молекулы ПНЖК (16-, 17-, 18-, 19-, 20-НЕТЕ) даетвозможность получения различных производных, в том числе, азидов, путемнемногочисленных модификаций. Кроме того, --4 гидроксилированные ПНЖКмогут использоваться для исследования механизмов окислительного метаболизмалипидов с участием других ферментов каскада АК, включая циклооксигеназу ицитохром P-450.Большинство ранее предложенных энантиоспецифических методов синтеза-4гидроксилированныхпроизводныхАКоснованынапринципеолефинирования по Виттигу [205–208], который не обеспечивает возможностиселективного введения радиоактивной метки в молекулу ПНЖК, необходимой дляпроведениябиологическихисследований.Внастоящейработецелевыесоединения были впервые получены на основе полного химического синтеза сприменением полиацетиленового подхода. Ацетиленовая связь служит удобнымпредшественником (Z)-двойной связи, а методы, разработанные в применении ксинтезу природных полиненасыщенных структур и лежащие в основе построенияполиацетиленовой цепи (кросс-сочетание пропаргильных галогенидовс-ацетиленовыми соединениями), обеспечивают возможность создания системыдвойныхсвязейтребуемойконфигурациисодновременнымвведениемфункциональных группировок.
Особым преимуществом предложенного методаявляется возможность введения радиоактивной метки на конечных стадияхсинтеза, что позволяет минимизировать количество манипуляций с радиоактивномечеными соединениями.47Ретросинтетическийанализ(Схема2)показывает,что-4гидроксилированные производные АК могут быть получены в рамках единойсинтетической схемы кросс-сочетанием региоизомеров (бензоилокси)гептина (1),Схема 2бифункционального производного 7-бром-2,5-гептадиинола (2) [209] и метиловогоэфира5-гексиновойкислоты(3)вусловияхобразованияпромежуточныхметаллоорганических комплексов переходных металлов – Cu (I) [210].
В основусинтеза -3-4 гидроксикислот, для которых в рамках поставленных задачсуществовала необходимость выхода на оптически активные изомеры, положеноиспользованиекакисходныхсоединенийсзаданнойконфигурациейасимметрического центра, так и принципа препаративного разделения конечныхрацемических продуктов на оптически активные изомеры.4.1.1.Синтезрегиоизомерныхпоположениюгидроксигруппытерминальных ацетиленов (1). rac-3-(Бензоилокси)гепт-1-ин (1a), ключевойсинтон в cинтезе rac-16-НЕТЕ и ее производных был получен алкилированиемкоммерческидоступногопентаналя(4)литиевымпроизводнымэтинилтриметилсилана (5) с последующей защитой гидроксильной группы иудалением триметилсилильной защиты [211]. (R)-4-(Бензоилокси)гепт-1-ин (1b) былполучен исходя из (S)-эпихлоргидрина (7) [212] (Схема 2).
Раскрытие оксирановогоцикла по методу Ямагучи [213, 214] приводило к образованию (S)-1-хлор-5(триметил силил)пент-4-ин-2-ола (8). Замещение хлора на йод и удлинение цепи сиспользованием Et2CuMgBr, а также последующая защита гидроксильных групп и48Схема 3Условия: (a) TMSC≡CH (5), n-BuLi, ТГФ, -78oC, 0,5 ч; (b) BzCl, Py, бензол, 20oC, 10 ч;(c) n-Bu4NF, THF, 20oC, 2 ч; (d) TMSC≡CH (5), n-BuLi, BF3·Et2O, TГФ, -78oC, 40 мин; (e)NaI, ацетон, 65oC, 48 ч; (f) CuI, EtMgBr, TГФ-HMPA, от -78oC до -50oC; (g) NaI, ацетон,75oC, 15 ч; (h) TMSC≡CH (5), n-BuLi, HMPA, -20oC, 5 ч; (i) (COCl)2, CuI, MeLi, Et2O, -78oC(j) LiAlH4, TГФ, от -20oC до 0oCудаление триметилсилильной группы приводило к соединению 1b c общимвыходом 42%.
rac-3-(Бензоилокси)гепт-6-ин (1с), ключевое соединение в синтезеrac-18-НЕТЕ (44а), получен с общим выходом 53% исходя из rac-1-хлорпентан-3ола (10), который в свою очередь получали восстановлением коммерческидоступного хлор-3-пентанона действием NaBH4 [215]. Замещенный гептин 1d былсинтезирован исходя из 6-(триметилсилил)гекс-5-иновой кислоты (13) сочетаниемее хлорангидрида с диметилкупратом лития при -78oC по методу Познера [216] ивосстановлением карбонильной группы LiAlH4 с общим выходом 56% по четыремстадиям [217]. 1-(Бензоилокси)гепт-6-ин (1е) получали из 6-гептиновой кислоты (16)как показано на Схеме 3.4.1.2.
Синтез -4-3 замещенных оптически активных производныхарахидоновой кислоты. В основе синтеза rac-16-HETE (Схема 4) и 17(R)-HETE(Схема 5) лежит использование впервые полученных тетраацетиленов 19 и 29 вкачестве промежуточных соединений [211, 212].49Схема 4Условия: (a) CBr4, PPh3, CH2Cl2; (b) 3, CuI, NaI, K2CO3, ДМФ, 20oC; (c) H2 и обращенофазовая ВЭЖХ; (d) NaOMe, MeOH, 20oC и ВЭЖХ на хиральной фазе; (e) Me2NSF3,CH2Cl2, -78oC; (f) NaOH, MeOH–H2O, 20oC; (g) LiOH, MeOH–H2O, 20oC; (h) 3H2/катализатор Линдлара, бензол, 10oC.Триацетиленовые бромиды 18 и 28 были получены через соответствующие спирты17 и 27 кросс-сочетанием ключевого синтона 2 с терминальными ацетиленами 1а и1b, соответственно.
Последующее сочетание метилового эфира 5-гексиновойкислоты (3) с бромидами 18 и 28 приводило к образованию эфиров rac-16(бензоилокси)эйкоза-5,8,11,14-тетраиновой5,8,11,14-тетраиновой(29)кислот,(19)и17(R)-(бензоилокси)эйкоза-соответственно.Анализпродуктовстереоселективного гидрирования эфиров 19 и 29 на катализаторе Линдлара вбензолев присутствии хинолина (соотношение субстрат/катализатор 1:1, помассе) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ показал образование основного ипобочного продуктов гидрирования 20 и 24 в соотношении 3:1, а также продуктов31 и 32 в соотношении 2:1. В случае, когда соотношение субстрат/катализаторизменяливсторонууменьшенияколичествакатализатора(соотношениесубстрат/катализатор 3:1, по массе) наблюдался сдвиг равновесия в сторонуобразованияпобочногопродукта5024(соотношение20:24=1:1).При увеличении количества катализатора (соотношение 1:2, по массе), напротив,сдвиг происходил в сторону образования основного продукта 20 и наблюдалосьпрактически селективное образование соединения 31.5152Анализмасс-спектровполученныхсоединенийвусловияхотрицательнойхимической ионизации показал образование ключевых ионных фрагментов с m/z391 [M-181] / 301 [M-181-90] для TMS-PFB эфиров соединений 22 и 33а и 389 [M181] / 299 [M-181-90] для производных соединений 26 и 34а, соответственно.
Этиданные позволили предположить, что образование побочного продукта происходитвследствиенеполногокаталитическогогидрированиясубстратаиз-запространственных затруднений, создаваемых объемным остатком бензойнойкислоты (при C-16 и С-17 атомах углерода) в области C14-С15 тройной связи. 1НЯМР соединения 24 показал наличие характерного сигнала триплет-триплетовH=5,55 м.д., что является результатом развязки C-16 протона на атомах водородасоседней 17-СН2 группы (J = 6,4 Гц) и метиленовых протонов при С-13 (J = 1,7 Гц).Эти данные указывают на положение тройной связи между C-14 и С-15, чтопозволяетидентифицироватьсоединение24какrac-(5Z,8Z,11Z)-16-гидроксиэйкоза-5,8,11-триен-14-иновую кислоту. На основе масс-спектральныхданных и спектров двумерной гетероядерой 1H/13C корреляции (HMBC) (рис.
15)соединение 32 было идентифицировано как метиловый эфир (R,5Z,8Z,11Z)-17(бензоилокси)эйкоза-5,8,11-триен-14-иновой кислоты. При анализе спектральныхданных наблюдалась однозначная корреляция между ближними (C-15/H2-16) иудаленнымиатомами(C-15/H-17,C-15/H2-13).Крометого,наличиетрехперекрестных сигналов указывало на дополнительную корреляцию в ряду: C-14/H213, C-14/H-12 и C-14/H2-16 [187].[3Н8]-17(R)-HETE1 (30), меченая тритием по четырем двойным связям, былавпервые получена по методике [218] каталитическим гидрированием соединения29 с использованием 3Н2 на катализаторе Линдлара в бензоле с высокой удельнойактивностью (175-180 Ки/ммоль) и радиохимической чистотой более 98% [212]. Вслучае предшественника rac-(16)-HETE (18) введение метки по всем тройнымсвязям не применялось из-за необходимости применения ВЭЖХ для отделенияпобочного продукта 24, а так же дальнейшего хроматографического разделениярацематанаоптическиактивныесоединения21a,bи25a,b.Получениеэнантиомеров метиловых эфиров 16-НЕТЕ (21) и его 14,15-дегидроаналога 25осуществляли разделением рацемических смесей с использованием хиральнофазовой ВЭЖХ (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
