Диссертация (1090326), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Напротив, для мутанта Y98A эффектагрегации был ярко выражен. Хотя r12/15-LOX и Y98R мутант оставалисьотносительно стабильными до 30°C, Y98A образовывал при этой температуреболее крупные олигомеры (рис. 34В, правая панель). Таким образом, потеряароматическогодоменамивзаимодействияприводиткмеждуснижениюкаталитическимстабильностибелкаиN-терминальным[254],увеличениюолигомеризации и, как следствие, изменению функциональных свойств фермента.887.1.4. Роль N-концевого домена в стабилизации подвижной 2 спирали.Помимо N-терминального домена r12/15-LOX содержит еще один подвижныйструктурный элемент – 2 спираль.
В конформации фермента, свободной отлиганда (конформер А; PDB 2P0M), эта спираль состоит из 25 аминокислот(аминокислоты 169-193). В конформере Б (комплекс с лигандом) 2 теряет частьсвоей спиральной структуры (аминокислоты 169-176) и подвергается дислокации(~12 Å). Хотя молекулярные механизмы подобного конформационного переходаизучены недостаточно, можно предположить, что именно субстрат играетключевую роль в этом процессе, так как активный центр фермента в конформере Апросто не способен принять молекулу ПНЖК в субстрат-связывающую полость изза стерических ограничений. Таким образом, конформационная гибкость 2спирали и подвижность N-терминального домена по отношению к каталитическомудомену могут быть взаимосвязанными процессами.
Анализ кристаллическойструктуры свободного от лиганда конформера А r12/15-LOX (PDB 2P0M) позволилобнаружить наличие ряда контактов между остатками N-концевого домена (Ser13,Ile14, Tyr15) и 2 спирали (Leu168, Glu169, Asp170), которые, за исключениемводородной связи между карбоксильной группой Asp170 и амидной NH-группы Ile14(рис. 32А), имеют в основном гидрофобный характер. Доля поверхности,приходящейся на остатки Ile14 и Asp170, на 60-65% доступна молекулам воды (PISA),что делает маловероятным вклад водородных связей в стабилизацию структуры всольватированном состоянии.
С другой стороны, пространственная близостьостатков Ile14 и Asp170 делает возможным создание более стабильного солевогомостика путем незначительных модификаций белка. Для этой цели методомнаправленного мутагенеза Ile14 был заменен на положительно заряженный Lys.Хотя кривые денатурации как фермента дикого типа, так и мутанта I14K (рис. 35А)имели идентичное плато в диапазоне температур 47-55°C, мутант I14K, в отличиеот фермента дикого типа, продолжал терять свою вторичную структуру до 72 оС.Несмотря на то, что при 9°С КД спектры нативного фермента и мутанта былипрактически идентичными (рис. 35А, вставка), различия в их вторичной структуренаблюдались при температурах 37 и 53°C (рис. 35Б). Анализ вторичной структурыLOX дикого типа и ее I14K мутанта по методу Яанга [260] (37°С) показал, чтонативный фермент с долей -спиральной структуры 31,4 ± 0,8% теряет ее вбольшей степени, чем мутант (35,2 ± 0,9%).
При этом доля -складчатой структурыбелка оставалась неизменной (13,9 ± 0,1%). Таким образом, разница в 3,8 ± 1,7%от общей структуры белка свидетельствует о потере -структуры сегмента длинойв 25 аминокислот, что соответствует длине полной 2 спирали. Полученные89Рис. 35. Термостабильность r12/15-LOX и ее I14K мутанта. (A) Величиныинтенсивности сигнала КД 1 мкМ раствора белка при 220 нм показана как функциятемпературы. (Б) Сравнение КД-спектров при 37 и 53oC предполагает различныемеханизмы денатурации r12/15-LOX и ее I14K мутанта при повышенныхтемпературах.данные позволяют предположить, что повышенная подвижность N-терминальногодомена по отношению к каталитическому домену и потеря контактов саминокислотными остатками 2 спирали могут лежать в основе конформационногоперехода этого структурного элемента из состояния конформера А r12/15-LOX всостояние конформера Б.7.1.5.
Анализ третичной структуры и динамики конформационныхизменений r12/15-LOX дикого типа и мутантов. Для изучения стабильноститретичной структуры r12/15-LOX и динамики ее конформационных изменений вданной работе использовали анализ продолжительности эмиссии флуоресценцииостатков триптофанов в зависимости от температуры. При наличии ряда остатковтриптофановвструктуребелка,эмиссия90флуоресценциихарактеризуетсянепрерывным распределением продолжительности, которое содержит короткую(1La) и длинную (1Lb) компоненты [261]. Если вклад компоненты 1Lb в спектрыэмиссии незначителен [262], анализ компоненты 1Lb позволяет оценить природугидрофильного и/или гидрофобного окружения триптофановых остатков [263].
Приэтом ширина распределения эмиссии отражает конформационную разнородностьтретичной структуры, обусловленную структурными колебаниями в пределахнаносекунды [264, 265].Анализ продолжительности эмиссии флуоресценции триптофановых остатковr12/15-LOX показал, что разнородность сигнала уменьшается от 10°C и до 35°С, азатем возрастает с повышением температуры (рис.
36А). Напротив, ширина обеихкомпонент распределения для мутанта Y98R не изменялась вплоть до 40°С (рис.36Б). При 10°С короткая компонента распределения для фермента дикого типабыла почти в два раза шире соответствующей компоненты Y98R (рис. 36Б,вставка), что свидетельствовало о более быстрых переходах конформационныхподсостояний в случае мутанта. Этот результат можно объяснить как увеличениемподвижностижесткихструктурныхэлементов(N-иС-концевыхдоменов)относительно друг друга, так и наличием менее стабильной третичной структуры вцелом. В отличие от фермента дикого типа, ширина как короткой, так и длиннойкомпонент распределения для мутанта I14K была менее подвержена воздействиютемпературы в диапазоне от 10 до 35°С (рис. 36В). В условиях, когда температуранаходилась на отметке ниже 40°С, практически никакого эффекта не наблюдалось.С другой стороны, при дальнейшем повышении температуры структурнаяразнородность увеличивалась, достигая максимума при 55-60 °C.
Хотя подобнаятенденция прослеживалась как для фермента дикого типа, так и Y98R мутанта,ширина обеих компонент распределения мутанта I14K в диапазоне температур от10 до 35° превышала в 2,5 раза значения ширины соответствующих компонентраспределения фермента дикого типа и в 3-5 раз мутанта Y98R (рис. 36В, вставка).Эти различия показывают, что по сравнению с мутантом Y98R и r12/15-LOX мутантI14K имеет более жесткую и, возможно, более гидратированную структуру.Таким образом, боковые цепи Тyr98 и Тyr614 могут играть роль якорных групп,участвующих во взаимодействии N-терминальнго и каталитического доменовr12/15-LOX.Полученныеданныесвидетельствуютотом,чтоувеличениеподвижности N-концевого домена по отношению к каталитическому домену за счетпотери ароматического взаимодействия между доменами приводит к структурнымизменениям молекулы фермента, которые связаны с частичной дестабилизациейего вторичной и третичной структур.91Рис.
36. Температурная зависимость распределений продолжительностиэмиссии флуоресценции. Короткая (левый график) и длинная (правый график)компоненты распределений продолжительности эмиссии показаны раздельно.Вставка: ширина компоненты на уровне половины максимума распределения показанакак функция температуры. (A) Динамическая флуоресценция водного раствора r12/15LOX (1 мкM) в диапазоне температур от 10 до 52°C.
(Б) Динамическая флуоресценцияводного раствора Y98R мутанта (1 мкM) в диапазоне температур от 10 до 52°C. (В)Динамическая флуоресценция водного раствора r12/15-LOX (1 мкM) в диапазонетемператур от 10 до 52°C I14K мутанта.927.1.6. Вклад Arg403 в стабильность структуры r12/15-LOX. Arg403является якорной детерминантой r12/15-LOX, которая, как предполагают, вступаетво взаимодействие с карбоксильной группой ПНЖК в процессе ферментногосвязывания [266, 267]. Анализ кристаллической структуры r12/15-LOX [56], а такжемоделирование с использованием методов молекулярной динамики для ферментадикого типа [268, 269], не содержащего лиганда, показали, что Arg403 образуетводородные мостики с боковой цепью Glu176 (спираль α2), Glu399 и взаимодействуетс Lys172. Glu399, в свою очередь, в процессе моделирования образует непостоянныеводородныесвязисArg166(рис.37А)[119,120].ПрипотереионногоРис.
37. Результаты моделирования молекулярной динамики для r12/15-LOX (А)и мутанта Arg403Leu (Б).взаимодействия (замена Arg403 на Leu) происходит реорганизация в структуребелка (рис. 37Б), при которой Glu399 находит нового партнера для образованияводородной связи (Lys172) [270]. Интересно отметить, что Lys172 находится вначальном сегменте α2 спирали, элементы которго теряют свою α-спиральнуюструктуру в результате конформационного перехода при связывании с ингибитором(конформер Б, PDB 2Р0М).
Кроме того, при замене Arg403 на Leu, водородныемостики между атомом азота амидной группы остатка в положении 403 икарбоксильной группой Glu399 ослабевают, что, как следствие, приводит кструктурной перестройке участка цепи, содержащей остатки Glu399 и Arg403. Посравнению с данными, полученными для фермента дикого типа, исследования сприменениемметодовсущественноеизменениединамикойшириныфлуоресценциираспределения[262–265]короткойпоказаликомпонентыпродолжительности эмиссии флуоресценции мутанта R403L (рис.
38А и 38Б)93Рис. 38. Температурная зависимость продолжительности распределенийэмиссиифлуоресценции. Показаны короткие компоненты распределенийпродолжительности эмиссии для водного раствора r12/15-LOX (1 мкM) в диапазонетемператур от 10 до 50°C (A) и для водного раствора мутанта R403L (1 мкM) вдиапазоне температур от 10 до 48°C (Б). Центр масс спектра эмиссиифлюоресценции r12/15-LOX и мутанта R403L как функция давления (В). Кинетикаденатурации r12/15-LOX и мутанта R403L как функция концентрации GdnHCl (Г).Экспериментальные значения представляют собой величины интенсивности сигнала вспектрах флюоресценции и кругового дихроизма при 222 нм.