Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1090326), страница 16

Файл №1090326 Диссертация (Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов – 1215-липоксигеназ) 16 страницаДиссертация (1090326) страница 162018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 16)

Напротив, для мутанта Y98A эффектагрегации был ярко выражен. Хотя r12/15-LOX и Y98R мутант оставалисьотносительно стабильными до 30°C, Y98A образовывал при этой температуреболее крупные олигомеры (рис. 34В, правая панель). Таким образом, потеряароматическогодоменамивзаимодействияприводиткмеждуснижениюкаталитическимстабильностибелкаиN-терминальным[254],увеличениюолигомеризации и, как следствие, изменению функциональных свойств фермента.887.1.4. Роль N-концевого домена в стабилизации подвижной 2 спирали.Помимо N-терминального домена r12/15-LOX содержит еще один подвижныйструктурный элемент – 2 спираль.

В конформации фермента, свободной отлиганда (конформер А; PDB 2P0M), эта спираль состоит из 25 аминокислот(аминокислоты 169-193). В конформере Б (комплекс с лигандом) 2 теряет частьсвоей спиральной структуры (аминокислоты 169-176) и подвергается дислокации(~12 Å). Хотя молекулярные механизмы подобного конформационного переходаизучены недостаточно, можно предположить, что именно субстрат играетключевую роль в этом процессе, так как активный центр фермента в конформере Апросто не способен принять молекулу ПНЖК в субстрат-связывающую полость изза стерических ограничений. Таким образом, конформационная гибкость 2спирали и подвижность N-терминального домена по отношению к каталитическомудомену могут быть взаимосвязанными процессами.

Анализ кристаллическойструктуры свободного от лиганда конформера А r12/15-LOX (PDB 2P0M) позволилобнаружить наличие ряда контактов между остатками N-концевого домена (Ser13,Ile14, Tyr15) и 2 спирали (Leu168, Glu169, Asp170), которые, за исключениемводородной связи между карбоксильной группой Asp170 и амидной NH-группы Ile14(рис. 32А), имеют в основном гидрофобный характер. Доля поверхности,приходящейся на остатки Ile14 и Asp170, на 60-65% доступна молекулам воды (PISA),что делает маловероятным вклад водородных связей в стабилизацию структуры всольватированном состоянии.

С другой стороны, пространственная близостьостатков Ile14 и Asp170 делает возможным создание более стабильного солевогомостика путем незначительных модификаций белка. Для этой цели методомнаправленного мутагенеза Ile14 был заменен на положительно заряженный Lys.Хотя кривые денатурации как фермента дикого типа, так и мутанта I14K (рис. 35А)имели идентичное плато в диапазоне температур 47-55°C, мутант I14K, в отличиеот фермента дикого типа, продолжал терять свою вторичную структуру до 72 оС.Несмотря на то, что при 9°С КД спектры нативного фермента и мутанта былипрактически идентичными (рис. 35А, вставка), различия в их вторичной структуренаблюдались при температурах 37 и 53°C (рис. 35Б). Анализ вторичной структурыLOX дикого типа и ее I14K мутанта по методу Яанга [260] (37°С) показал, чтонативный фермент с долей -спиральной структуры 31,4 ± 0,8% теряет ее вбольшей степени, чем мутант (35,2 ± 0,9%).

При этом доля -складчатой структурыбелка оставалась неизменной (13,9 ± 0,1%). Таким образом, разница в 3,8 ± 1,7%от общей структуры белка свидетельствует о потере -структуры сегмента длинойв 25 аминокислот, что соответствует длине полной 2 спирали. Полученные89Рис. 35. Термостабильность r12/15-LOX и ее I14K мутанта. (A) Величиныинтенсивности сигнала КД 1 мкМ раствора белка при 220 нм показана как функциятемпературы. (Б) Сравнение КД-спектров при 37 и 53oC предполагает различныемеханизмы денатурации r12/15-LOX и ее I14K мутанта при повышенныхтемпературах.данные позволяют предположить, что повышенная подвижность N-терминальногодомена по отношению к каталитическому домену и потеря контактов саминокислотными остатками 2 спирали могут лежать в основе конформационногоперехода этого структурного элемента из состояния конформера А r12/15-LOX всостояние конформера Б.7.1.5.

Анализ третичной структуры и динамики конформационныхизменений r12/15-LOX дикого типа и мутантов. Для изучения стабильноститретичной структуры r12/15-LOX и динамики ее конформационных изменений вданной работе использовали анализ продолжительности эмиссии флуоресценцииостатков триптофанов в зависимости от температуры. При наличии ряда остатковтриптофановвструктуребелка,эмиссия90флуоресценциихарактеризуетсянепрерывным распределением продолжительности, которое содержит короткую(1La) и длинную (1Lb) компоненты [261]. Если вклад компоненты 1Lb в спектрыэмиссии незначителен [262], анализ компоненты 1Lb позволяет оценить природугидрофильного и/или гидрофобного окружения триптофановых остатков [263].

Приэтом ширина распределения эмиссии отражает конформационную разнородностьтретичной структуры, обусловленную структурными колебаниями в пределахнаносекунды [264, 265].Анализ продолжительности эмиссии флуоресценции триптофановых остатковr12/15-LOX показал, что разнородность сигнала уменьшается от 10°C и до 35°С, азатем возрастает с повышением температуры (рис.

36А). Напротив, ширина обеихкомпонент распределения для мутанта Y98R не изменялась вплоть до 40°С (рис.36Б). При 10°С короткая компонента распределения для фермента дикого типабыла почти в два раза шире соответствующей компоненты Y98R (рис. 36Б,вставка), что свидетельствовало о более быстрых переходах конформационныхподсостояний в случае мутанта. Этот результат можно объяснить как увеличениемподвижностижесткихструктурныхэлементов(N-иС-концевыхдоменов)относительно друг друга, так и наличием менее стабильной третичной структуры вцелом. В отличие от фермента дикого типа, ширина как короткой, так и длиннойкомпонент распределения для мутанта I14K была менее подвержена воздействиютемпературы в диапазоне от 10 до 35°С (рис. 36В). В условиях, когда температуранаходилась на отметке ниже 40°С, практически никакого эффекта не наблюдалось.С другой стороны, при дальнейшем повышении температуры структурнаяразнородность увеличивалась, достигая максимума при 55-60 °C.

Хотя подобнаятенденция прослеживалась как для фермента дикого типа, так и Y98R мутанта,ширина обеих компонент распределения мутанта I14K в диапазоне температур от10 до 35° превышала в 2,5 раза значения ширины соответствующих компонентраспределения фермента дикого типа и в 3-5 раз мутанта Y98R (рис. 36В, вставка).Эти различия показывают, что по сравнению с мутантом Y98R и r12/15-LOX мутантI14K имеет более жесткую и, возможно, более гидратированную структуру.Таким образом, боковые цепи Тyr98 и Тyr614 могут играть роль якорных групп,участвующих во взаимодействии N-терминальнго и каталитического доменовr12/15-LOX.Полученныеданныесвидетельствуютотом,чтоувеличениеподвижности N-концевого домена по отношению к каталитическому домену за счетпотери ароматического взаимодействия между доменами приводит к структурнымизменениям молекулы фермента, которые связаны с частичной дестабилизациейего вторичной и третичной структур.91Рис.

36. Температурная зависимость распределений продолжительностиэмиссии флуоресценции. Короткая (левый график) и длинная (правый график)компоненты распределений продолжительности эмиссии показаны раздельно.Вставка: ширина компоненты на уровне половины максимума распределения показанакак функция температуры. (A) Динамическая флуоресценция водного раствора r12/15LOX (1 мкM) в диапазоне температур от 10 до 52°C.

(Б) Динамическая флуоресценцияводного раствора Y98R мутанта (1 мкM) в диапазоне температур от 10 до 52°C. (В)Динамическая флуоресценция водного раствора r12/15-LOX (1 мкM) в диапазонетемператур от 10 до 52°C I14K мутанта.927.1.6. Вклад Arg403 в стабильность структуры r12/15-LOX. Arg403является якорной детерминантой r12/15-LOX, которая, как предполагают, вступаетво взаимодействие с карбоксильной группой ПНЖК в процессе ферментногосвязывания [266, 267]. Анализ кристаллической структуры r12/15-LOX [56], а такжемоделирование с использованием методов молекулярной динамики для ферментадикого типа [268, 269], не содержащего лиганда, показали, что Arg403 образуетводородные мостики с боковой цепью Glu176 (спираль α2), Glu399 и взаимодействуетс Lys172. Glu399, в свою очередь, в процессе моделирования образует непостоянныеводородныесвязисArg166(рис.37А)[119,120].ПрипотереионногоРис.

37. Результаты моделирования молекулярной динамики для r12/15-LOX (А)и мутанта Arg403Leu (Б).взаимодействия (замена Arg403 на Leu) происходит реорганизация в структуребелка (рис. 37Б), при которой Glu399 находит нового партнера для образованияводородной связи (Lys172) [270]. Интересно отметить, что Lys172 находится вначальном сегменте α2 спирали, элементы которго теряют свою α-спиральнуюструктуру в результате конформационного перехода при связывании с ингибитором(конформер Б, PDB 2Р0М).

Кроме того, при замене Arg403 на Leu, водородныемостики между атомом азота амидной группы остатка в положении 403 икарбоксильной группой Glu399 ослабевают, что, как следствие, приводит кструктурной перестройке участка цепи, содержащей остатки Glu399 и Arg403. Посравнению с данными, полученными для фермента дикого типа, исследования сприменениемметодовсущественноеизменениединамикойшириныфлуоресценциираспределения[262–265]короткойпоказаликомпонентыпродолжительности эмиссии флуоресценции мутанта R403L (рис.

38А и 38Б)93Рис. 38. Температурная зависимость продолжительности распределенийэмиссиифлуоресценции. Показаны короткие компоненты распределенийпродолжительности эмиссии для водного раствора r12/15-LOX (1 мкM) в диапазонетемператур от 10 до 50°C (A) и для водного раствора мутанта R403L (1 мкM) вдиапазоне температур от 10 до 48°C (Б). Центр масс спектра эмиссиифлюоресценции r12/15-LOX и мутанта R403L как функция давления (В). Кинетикаденатурации r12/15-LOX и мутанта R403L как функция концентрации GdnHCl (Г).Экспериментальные значения представляют собой величины интенсивности сигнала вспектрах флюоресценции и кругового дихроизма при 222 нм.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6384
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее