Диссертация (1090326), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Более того, такая модель не объясняет экспериментальные данные,полученные для L183E+L192E мутанта в присутствии лиганда. Структурный анализпоказывает, что 2 спирали в модели тетрамера не имеют контакта (рис. 48В).Хотя в отличие от W181E+H585E двойной мутант L183E+L192E находится волигомерном состоянии, полученные данные ясно показывают, что мутацииаминокислот Leu183, Leu192, Trp81, His585 приводят к дестабилизации интерфейсадимера, который присутствует в ферменте дикого типа.113Изучение7.2.5.устойчивостидимеровфермент-субстратногокомплекса r12/15-LOX и мутантов с использованием методов молекулярнойдинамики8.Длявыясненияспособностиr12/15-LOXобразовыватьмежмолекулярные ассоциаты в присутствии субстрата (АК), были созданы моделидимеров фермента дикого типа и мутантов (W181E+H585E и L183E+L192E), вкоторых конформер А являлся не содержащей лиганда молекулой, тогда какконформер Б был связан с АК в активном центре.
Моделирование было проведеновусловияхполнойсольватациимолекулфермента.Несколькосвободноперемещающихся катионов натрия были помещены в систему для поддержания еенейтральности. Анализ траекторий (4 нс) мутанта W181E+H585E показалраскрытие межмолекулярного интерфейса (рис. 49А и 49В) в результатеэлектростатического отталкивания, сопровождаемого переориентацией боковыхцепей Glu585 (конформер А) и Glu181 (конформера B). Переориентация остатковаминокислот по сайтам мутации вызывала проникновение молекул воды и, вконечномитоге,катионовнатриявмежмолекулярноепространстводлястабилизации этой области (рис. 49В), приводя к изменениям в гидрофобной частиинтерфейса (остатки лейцина).
В процессе моделирования наблюдалось вращениеконформера А относительно конформера B, в результате чего площадьмежмолекулярного интерфейса уменьшалась с 116449 Å2 (фермент дикого типа)до 69310 Å2 (рис. 49А). При анализе траекторий мутанта L183E+L192E такженаблюдалось уменьшение площади межмолекулярного интерфейса до 71266 Å2.В этом случае происходили значительные изменения координат 2 спираликонформера B, что приводило к уменьшению площади интерфейса (рис. 49Б). Хотяпараллельное электронное взаимодействие между His585 (конформер А) иTrp181 (конформер Б), наблюдающееся в кристаллической структуре, сохранялосьнекоторое время, оба остатка принимали новые конформации, в которых ихплоскости были повернуты перпендикулярно друг другу (рис.
48Г). Напротив, вферменте дикого типа электронное взаимодействие между His585 и Trp181сохранялось на протяжении всей траектории и гидрофобные взаимодействияинтерфейса оставались стабильным, сохраняя площадь поверхности в 116449 Å28Выполненогруппой проф. А. Гозалес-Лафонт в Институте биотехнологии ибиомедицины Автономного университета г.
Барселоны, Испания. Участие диссертантазаключалось в постановке задачи и анализе полученных результатов114Рис. 49. Сопоставление структур интерфейса в димере: (А) димера фермента дикоготипа (красный) с димером мутанта W181E+H585E (серый) и (Б) димера ферментадикого типа (красный)с димером мутанта L183E+L192E (желтый). (В) Фрагментинтерфейса в димере W181E+H585E в 4 нс траектории. (Г) Фрагмент интерфейса вдимере L183E+L192E в 4 нс. траектории.
(Д) Фрагмент интерфейса в димерефермента дикого типа в 4 нс траектории.115(рис. 48Д). При этом 2 спираль обладала достаточной подвижностью, сохраняяпри этом совместный интерфейс димера.7.2.6. Влияние межмолекулярных контактов в димерном интерфейсебелка на ферментативные свойства r12/15-LOX.
Для изучения влияниямежмолекулярных контактов интерфейса в димере r12/15-LOX на функциональныесвойства r12/15-LOX была изучена кинетика окисления АК и ЛК под действиемпрепаратовферментадикоготипа,атакжемутантовW181E+H585EиL183E+L192E. Кинетика реакции фермента дикого типа с природными субстратамив приближении описывается уравнением Михаэлиса-Ментена. Для ЛК и АК былиполучены величины КМ* 21,3±3,6 мкм и 15,5±1,5 мкМ. Максимальные скоростикаталитического цикла (kcat) составили 47,23±2,83 с-1 и 11,26±0,56 с-1 (рис. 50A,табл. 19), соответственно. Напротив, кинетика ферментативной реакции двойныхмутантов не описывалась законом Михаэлиса-Ментена даже в области низкихконцентраций субстрата, при которых суицидальная инактивация фермента поддействием продуктов окисления ПНЖК минимальна.
Оба мутанта подвергалисьярко выраженной инактивации при увеличении концентрации субстрата начиная с5-15 мкм и выше (рис. 50А и 50Г). Аналогичный эффект наблюдался в присутствииТаблица 19. Кинетические параметры ферментативной реакции r12/15-LOX,W181E+H585E и L183E+L192E мутантовферментЛКkcat,с-1АКkcat/KM*,с-1мкМ-1дикий тип47,23±2,83W181E+H585Eсубстратное ингибирование2,21±0,13kcat,с-111,26±0.56kcat/KM*,с-1мкM-11,38±0.16субстратное ингибированиеH585E21,20±3,111,07±0,1615,78±0.873,20±0.41W181E39,84±6,221,61±0,2554,40±2.018,32±0.51L183E+L192Eсубстратное ингибированиесубстратное ингибированиеаллостерического эффектора, 13(S)-НрODE (рис. 50E). В мономерах r12/15-LOX(PDB 2P0M), как в конформере А, так и в конформере Б, боковые цепи а.о. поместу введения мутации должны находиться в контакте с растворителем, чтоделает мало вероятным наличие каких-либо существенных изменений в активномцентре фермента в результате мутаций.
С другой стороны, как показано на116примере W181E+H585E, корреляция между концентрацией белка и количествомсубстрата, необходимым для инактивации фермента (рис. 50В), предполагаетпрямое субстратное ингибирование. Если мутация Н585Е оказывала минимальныйэффект на окисление как ЛК, так и АК (рис 50Б, Д; табл. 19), то замена Trp181 наглутаминовую кислоту, по сравнению с ферментом дикого типа, вызываласемикратное увеличение эффективности окисления АК (kcat/K*M), (рис 50Д; табл. 18).При этом скорости окисления ЛК и АК в области низких концентраций субстратастановились сопоставимыми.Рис.
50. Кинетические кривые зависимости скорости ферментативнойреакции r12/15-LOX, W181E+H585Eконцентрации субстрата.117иL183E+L192EмутантовотИзучение траекторий флуктуации полиеновой цепи субстрата в комплексе сr12/15-LOX показывает, что терминальная часть молекулы АК, находящаяся вблизиа.о. Ile593/Ile597 спирали α18, практически зажата, тогда как цепь ЛК обладаетбольшей степенью свободы [270]. Подытоживая полученные данные можнозаключить, что в случае, когда две молекулы фермента r12/15-LOX работаютсовместно, Trp181 за счет своей объемной боковой цепи создает стерическиезатруднения в координации мономеров (2 и 18 спиралей) димернго комплексафермента с АК, что делает более короткую молекулу ЛКпредпочтительнымсубстратом.
Результаты структурно-кинетических исследований показывают, чтодестабилизация интерфейса димера вследствие мутации приводит к нарушениюфункциональных свойств фермента, в результате которых наблюдается сильноеингибирование фермента субстратом. До тех пор, пока оба конформера А и Бфермента дикого типа сохраняют межмолекулярный контакт, гидрофобные 2спирали защищены от доступа молекул воды. В случае раскрытия интерфейса поместу мутаций спирали 2 вступают в контакт с избыточным количеством ПНЖКилиихпродуктов,предположениечтосопровождаетсяподкрепляетсяинактивациейлитературнымифермента.данными,Этопоказывающимивозможность ковалентной модификации аминокислот 2 спирали 12/15-LOXферментативным продуктом окисления АК (15(S)-HpETE) [147].7.2.7.
Роль аминокилотных остатков 18 спирали в конформационныхпереходах r12/15-LOX. Как предполагалось ранее [152], аллостерические свойстваи каталитическая активность липоксигеназ определяются не только внешнейструктурной организацией фермента (образование переходных димеров), но иизменениями в активном центре комплекса фермент-субстрат, главным образом вобласти 18 спирали, ограничивающей размер субстрат связывающей полости.Таблица 20.
Контакты боковой цепи Gln596 на расстоянии удаления 4.5Å.Димер A:B,содержащий АК вконформере БКомплексКомплексс АК, Åс ЛК, ÅGln596–Ile1733,54,64,6Gln596–Phe1750,91,90,7Leu597–Ile1732,11,11,6--1,6КонтактыGln596(B)–Leu192(A)118Анализ контактов в комплексах r12/15-LOX с АК [119] и ЛК [120], полученных спомощью метода молекулярного моделирования, показал потенциальное участиеостатка Gln596 (18 спираль) в конформационных изменениях структуры r12/15-LOXв условиях переходного состояния. В конформере Б, содержащем как АК, так и ЛК,а так же комплексе димера с АК [279], этот остаток полностью окружен молекуламиводы.
Хотя в процессе моделирования он не образует постоянных водородныхсвязей ни с одним из окружающих его а.о., Ile173 и Phe175 (2 спираль) находятся вего непосредственной близости (табл. 20). Ile173 образует контакты с Leu597, приэтом оба этих остатка также контактируют с субстратом.Мутация Q596L (табл. 21, рис.
51) ухудшала ферментативные свойстваферментного препарата и вызывала частичное субстратное ингибирование прииспользовании АК в качестве субстрата. Подобный эффект наблюдался и раньшедля мутантов Y98R, R403R и W181E+H585E, что может быть связан сконформационными изменениями в интерфейсе димера. Повторный анализТаблица 21. Кинетические параметры ферментативной реакции r12/15-LOX,мутантов Q596A и Q596LферментЛКkcat,s-1АКkcat/KM*,s-1µM-1kcat,s-1kcat/KM*,s-1µM-1дикий тип44,2±2,42,611,3±0,61,38±0,16Q596A80,7±8,80,7448,3±4,41,22Q596L17,7±1,70,79--интерфейса (программа FoldX) между конформером А и конформером Б (рис. 41)действительно показал, что Gln596 вносит существенный вклад в энергиюсвязывания.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
