Диссертация (1090326), страница 21
Текст из файла (страница 21)
По-сравнению с ферментом дикого типа, мутация Q596А, напротив,вызывала четырехкратное увеличение эффективности катализа (kcat/K*M) (рис 51;табл. 21). При этом эффективности окисления АК этим мутантом и ЛК ферментомдикого типа становилась сопоставимыми. Хотя в случае с ЛК скоростьферментативнойреакцииивырасталавдвараза(kcat),эффективностькаталитического процесса под действием мутанта Q596А понижалась в 3,5 раза.Таким образом, можно заключить, что структурная реорганизация фермента неявляется его абсолютным свойством, а в случае каждого индивидуального119Рис.
51. Кинетические кривые зависимости скорости ферментативной реакцииr12/15-LOX, Q596A и Q596Lмутантов от концентрации субстрата.субстрата зависит от его природы и структуры боковых аминокислотных остатков2 и 18 спиралей, определяющих конечную структуру транзитного состояния.120ЗАКЛЮЧЕНИЕВ задачу настоящего исследования входило создание концептуально новойструктурно-кинетической модели 12/15-LOX высших млекопитающих, в основукоторой положен динамический характер взаимодействия этого фермента ссубстратами, ПНЖК и кислородом, в условиях конформационной подвижностибелковой матрицы.
Ортологи 12/15-LOX высших млекопитающих (H. sapiens [288],H. neandertals [289], H. denisovans [290], P. pygmeus [113]) катализируют окислениеАК в основном по 15-му положению. Низшие млекопитающие (М. Musculus [182], Р.norwegicus [291], Sus scrofa [179]), включая низших приматов (макака и орангутан),напротив, демонстрируют 12-липоксигеназную активность, тогда как 12/15-LOXгиббона представляет собой переходный вариант [292 и ссылки]. Хотя кроликявляется исключением из этого правила, у него найдено два фермента, один изкоторыхобладаетпреимущественно12-липоксигеназойактивностью(лейкоцитарный тип), тогда как другой – эритроцитарный – тип являющийсянаиболее близким по структурно-каталитическим свойствам к 12/15-LOX человека(h12/15-LOX), катализирует окисление АК в основном по 15-му положению.Исследования, проведенные в данной работе, показывают, что 12/15-LOXобладают большой степенью структурной гибкости [194, 254, 270, 279, 281, 293].При взаимодействии с субстратом или его продуктом они могут подвергатьсяструктурной реорганизации в области субстрат-связывающего кармана (18спираль) и его внешних структурных элементов (N-терминального домена и 2спирали), приводящей к образованию переходных димерных комплексов [279].Подобная межмолекулярная организация объясняет аллостерический характерэтой группы ферментов, для которых, как ЛК, так и продукт ее окисления, 13(S)H(p)ODE, приводят 12/15-LOX в каталитически компетентное состояние, повышаясродство фермента к АК.
Структурная реорганизация фермента не является егоабсолютным свойством, а в случае каждого индивидуального субстрата зависит отего природы боковых а.о. 2 и 18 спиралей, определяющих конечную структурутранзитного состояния. Если в реакции с ЛК ее продукт и эндогенный активатор13(S)-H(p)ODE постоянно присутствует в системе, то в случае образованияферментного комплекса с АК требуется постоянное присутствие экзогенногоаллостерического активатора – 13(S)-HpODE или 13(S)-HODE [26, 27] длядостижения максимальной скорости ферментативной реакции. Когда эндогенныйпродукт является недостаточно хорошим активатором, как это показано на примере19-HEТЕ [241], или не является им вовсе, промежуточные радикальные комплексыфермента могут распадаться, приводя к выходу фермента из каталитического121цикла в неактивной Fe2+-форме, что, как следствие, требует его дополнительнойреактивации.
При этом кислород, второй липоксигеназный субстрат, которыйпоступаетвактивныйцентрферментанаосновемеханизмовстрогоконтролируемого транспорта, может служить активатором фермента, что являетсяновой ранее не описанной функцией.122ВЫВОДЫ1.Предложен дизайн и осуществлен синтез новых зондов активного центра r12/15LOX на основе региоизомерных производных АК в качестве фотоаффинныхмаркеров, а так же ингибиторов липоксигеназ.
Впервые осуществлен синтез 4 гидроксилированных ПНЖК на основе их ацетиленовых предшественников.2.Разработаны рациональные и технологичные подходы введения тритиевойметки в структуру зондов активного центра r12/15-LOX. Показано, что наличиебензоатов (OBz) в качестве защиты ОН-группы в непосредственной близости оттройной связи препятствует каталитическому восстановлению последней.3.Показанаустойчивостьарахидоновойкислотырегиоизомерныхвусловияхвторичныхкаталитическогоазидопроизводныхвосстановлениянакатализаторе Линдлара в апротонных растворителях.4.Детальноизученыпроцессыфермент-субстратногосвязываниясиспользованием полученных соединений, разработаны и оптимизированыусловия для введения фотоаффинной метки в r12/15-LOX.5.Предложена расширенная кинетическая модель липоксигеназной реакции,предполагающая участие молекулярного кислорода в процессах активациифермента и создана подробная модель, описывающая механизм транспортакислорода в r12/15-LOX.6.С применением стратегии направленного мутагенеза, МРР, методов круговогодихроизма и динамической флуоресценции изучено взаимодействие между Nтерминальным доменом и каталитической субъединицей и показана рольмеждоменного взаимодействия в структуре фермента.7.Впервые показана рольаллостерического эффектора (13(S)-H(p)ODE)вкачестве молекулярного триггера, который сдвигает динамическое равновесие вряду мономер–димер между молекулами фермента в водной среде в сторонуобразования переходного димерного комплекса.8.Сиспользованиемметодовмолекулярнойдинамикиикомпьютерногомоделирования показана стабильность переходных димерных комплексовr12/15-LOX в присутствии связанного субстрата (АК).1239.Предложена новая структурная модель липоксигеназного катализа, котораяпредусматривает образование переходных димеров фермента в качествекаталитически активной единицы на предкаталитической стадии.124ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬЭксперимент к главе 4Материалы и общие методыН ЯМР и 13С ЯМР-спектры регистрировали на спектрофотометре Brucker MSL1200, Brucker MSL 300, Brucker Biospin AV400 или Brucker MSL 500 при 200, 300, 400или 500 MГц в CDCl3 (13C=77,24 м.д.
для CDCl3) или d6-ДМСО в качестверастворителей и тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта.77спектрыIIрегистрировалинаспектрофотометреBruckerAvanceSe ЯМР300сиспользованием Se(СН3)2 в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвигиприведенывмилионныхдолях(м.д.),значенияконстантспин-спиновоговзаимодействия - в герцах (Гц). ИК-спектры регистрировали на спектрофотометреIR-435 (Shimadzu- Япония) или Nicolet Avatar 360 FT-IR (Thermo ElectronCoirporation, США).
Частоты поглощения приведены в обратных сантиметрах (см-1).ВЭЖХ соединений (20-26, 31-40 и 44-47) проводили на жидкостном хроматографеLC-10Avp, оснащкнным с SPD-10Advp УФ-детектором (Shimadzu, Япония) наколонке Nucleosil C18; 250 х 4 мм, размер частиц 5 мкм (Machery-Nagel, Германия).Для анализа соединений 20, 24, 31, 32 были использованы: МеОН/Н2О (95:5, пообъему) и скорость потока элюента 1 мл/мин, для всех остальных соединений –МеОН/Н2О (85:15, по объему) и скорость потока элюента 1 мл/мин. ПрепаративнуюВЭЖХ проводили на колонке Lichrospher 100 RP 18; 250х22,5 мм, размер частиц 10мкм (Knauer, Германия) в системе ратворителей МеОН/Н2О (95:5, по объему) прискорости потока элюента 10 мл/мин.
Разделение энантиомеров 21а и 21b, а так же25а и 25b осуществляли на колонках Chiralpack AD 250 х 4-6 мм (Daicel ChemicalIndustries, США) или Chiralpack AD 250 х 10 мм (Daicel Chemical Industries, США),используя систему н-гексан/МеОН (98:2, по объему) в качестве системырастворителейискоростипотокаэлюента1мл/мин.Масс-спектры(EI)регистрировали на приборе GC-MS QP-2000 (Shimadzu, Япония), при температуреинжектора 280 oC, температуре источника ионов 180 oC и энергии электронов в 70эВ(прямойввод).Газовуюхроматографию/масс-спектроскопию (GC/MS)сотрицательной ионизацией TMS-PFB эфиров соединений 22а и 33а осуществлялис помощью системы Shimadzu QP-5050A (Япония) на колонке GC DB-1 (30 м,толщина покрытия 0,25 мм) (J & W Scientific, США). В качестве газа-носителяиспользовалигелий прирасходев12524мл/мин.Образцы элюировали сиспользованием температурной программы: изотермически при 150 oC в течение 3минут, от 150 до 190 oC со скоростью 10 oC /мин и от 190 до 310 oC со скоростью20 oC/мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
