Диссертация (1090326), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Анализ ВЭЖХ вторичных продуктов окисления Ме-АК r12/15-LOX и ееR403L мутантом на обращенной фазе. Методика выделения продуктов ианалитические условия приведены в экспериментальной части.продукта ферментативной реакции. При использовании метилового эфираарахидоновойкислоты(Ме-АК)вкачествесубстратадоля15(S)-Н(р)ETE(измерения проводили после щелочного гидролиза) слегка уменьшалась до 82%100дляферментадикоготипа,чтоснаходитсявсоответствиисранееопубликованными данными [106], и до 86% для мутанта R403L. Анализ вторичныхпродуктов окисления показал преимущественное образование: 5,15-DiH(р)ETE поддействием r12/15-LOX [275], тогда как действие мутанта R403L приводило кобразованию8,15-DiH(р)ETE(рис.41).Сдвигпозиционнойспецифичностипозволяет предложить, что в отличие от фермента дикого типа, в случае мутантаR403L субстрат принимает альтернативную конформацию, которая обеспечиваетболее глубокое проникновение его углеводородной цепи в полость активногоцентра.Рис.
42. Наложение структур r12/15-LOX ее мутанта R403L. Структура r12/15-LOXвыделена цветом морской волны, конформационные изменения, наблюдаемые вмутанте мутанта R403L в процессе симулирования молекулярной динамики – красными оранжевым цветом.Моделирование позволяет предположить, что потеря ионных взаимодействийпри замене Arg403 может привести к структурным изменениям 2 спирали, о чемсвидетельствуют различия в траекториях, полученные при моделировании дляфермента дикого типа и мутанта R403L [270].
В частности, у мутанта R403Lначальный сегмент 2-спирали и N-концевой домен сильнее отдаляются друг отдруга, чего не происходит в случае фермента дикого типа (рис. 42). Таким образом,потеряэлектростатическоговзаимодействиямеждуэтимиструктурнымиэлементами может также способствовать дестабилизации 2 спирали, как этопроисходит при потере гидрофобного взаимодействия N-концевого домена с ееоснованием [254]. Полученные данные свидетельствуют о том, что хотя Arg403 и не101являетсяобязательнойвзаимодействиесдетерминантойкарбоксильнойсубстратногогруппойПНЖКсвязывания,можетпривестиегокперераспределению ионных взаимодействий, которое также может вносить вкладконформационные переходы в молекуле фермента.1027.2.
Исследование межмолекулярных контактов r12/15-LOX в растворе77.2.1.СтруктураТермодинамическаяустойчивостькристаллографическогокомплексадимеровr12/15-LOXлипоксигеназы.сингибиторомпредставляет собой димер (PDB 2P0M) [56], состоящий из отличающихся друг отдруга по структуре мономеров А и Б. Мономер А представляет собой молекулуr12/15-LOX, не содержащую лиганда, в то время как мономер Б связан с молекулойРис. 43. Димерный интерфейс r12/15-LOX и варианты объединения мономеров.ингибитора и отличается по структуре от конформера А в области внешней 2спирали (рис.
43А) и 18 спирали, ограничивающей внутреннюю полость субстратсвязывающегокармана[56].Сцельюизучениястабильностиподобноймежмолекулярной организации были проведены термодинамические расчеты,учитывающие различные возможности ассоциации мономеров в димере: А:А, Б:Б иА:Б [276]. Многочисленные теоретические варианты объединения конформеров А иБ в димеры (рис. 43Б) обнаружили отрицательную энергию диссоциации (ΔGdiss<0),что предполагает отсутствие стабильными гомодимеров в водных растворах.Таблица 13. Термодинамическая устойчивость димеров r12/15-LOXДимерный интерфейсr12/15-LOX (PBD: 2Р0М)ВЕРХ-к-ВЕРХУ(A:Б)СПИНА-к-СПИНЕ (A:Б)7ИсследованияКоличествоаминокислотПлощадь[Å2]ΔGintинтерфейса[ккал/моль]ΔGdissдиссоциации[ккал/моль]37:3326:311335899-25-1010-1структур низкого разрешения методом МРР поведены на разгонном кольцеDORIS немецкого синхротрона совместно с группой д.х.н.
Д.И. Свергуна, Европейскаялаборатория молекулярной биологии, г. Гамбург, Германия103Напротив, расчеты свободной энергии (табл. 13) показывают, что асимметричныйинтерфейс «ВЕРХ-к-ВЕРХУ» в кристалле является термодинамически наиболеевыгодным вариантом.7.2.2.Влияниевнешнегоокружениянаструктуру r12/15-LOXврастворе. В отличие от структуры в кристалле, исторически считалось, что врастворе r12/15-LOX присутствует главным образом в виде мономера. Подобноерасхождение данных требовало детального изучения молекулярной организацииr12/15-LOXвводномрастворе.Дляэтойцелиметодоммалоугловогорентгеновского рассеяния (МРР) было исследовано влияние концентрациифермента, рН и ионной силы раствора на структуру r12/15-LOX.
Выбранныевеличины рН 6,8 и 8,0 находятся в пределах физиологического диапазона значенийРис. 44. (А и Б) Экспериментальные кривые МРР (черные точки) и модельполученная на основе линейной комбинации мономера и димера r12/15-LOX(красная линия). Экспериментальные данные скорректированы с учетомэкспериментальных кривых МРР буфера, не содержащего фермента. (В)Зависимость радиуса вращения от экспериментальных условий ( ■-рН 8.0; ●-рН 6.8;-рН 8.0 и 200мМ NaCl; ○-рН 6.8 и 200мМ NaCl. (Г) Влияние ионной силы растворана структуру низкого разрешения мономера r12/15-LOX. На рисунке представленосопоставление кристаллической структуры мономера r12/15-LOX со структуройнизкого разрешения фермента дикого типа в растворе в различных условиях..104рН, в которых фермент может находиться как в цитозольном, так и мембранносвязанном состоянии [277].
При низких концентрациях белка экспериментальныекривые малоуглового рентгеновского рассеяния достаточно хорошо совпадают срасчетными кривыми (рис. 44Б), полученными на основе структуры конформера А(PDB 2Р0М), тогда как с ростом концентрации наблюдается их расхождение (рис.44А) [259]. Более подробный анализ экспериментальных данных в условияхвозрастающей концентрации фермента и ионной силы раствора (от 0 до 200 мкМNaCl) предполагает образование полидисперсной системы. Зависимость величиныполученного радиуса вращения частиц (Rg) от концентрации белка (рис.
44В) прирН 6,8 показывает линейное увеличение значения Rg с повышением концентрациифермента. Так как для анализа были выбраны образцы без каких-либо признаковнеспецифическойагрегации,наличиеполидисперстностиможнообъяснитьсмещением равновесия мономер-димер в сторону образования димеров белка.При рН 8,0 подобная зависимость была менее выражена, что, по-видимому,связано с более высокой степенью гидратации молекулы фермента в основнойсреде. Интерпретация экспериментальных данных была проведена на основемоделирования с использованием метода «жесткого тела» (rigid body modeling)учитывающего возможность пространственной подвижности N-терминальногодомена по отношению к каталитическому домену и равновесия в ряду мономердимер r12/15-LOX (А:Б, PDB 2Р0М) (табл. 14) [278].Таблица 14. Доля мономеров и димеров в водных растворах r-12/15-LOXмодель на основеpHконцентрациябелка(мг/мл)6,88,0кристаллической структурыχмодель с учетом подвижностиN-терминального доменадолядолямономеров(%)димеров(%)χдолядолямономеров(%)димеров(%)0,82,6990102,699281,61,4187131,2788122,91,7378221,3478220,71,1087131,0687131,21,109461,0796421,3884161,228515χ фактор расхожденияАнализ полученных результатов показал, что в условиях буфера с низкой ионнойсилой (20 мМ Трис) даже при высокой концентрации белка доминирующая фракция105фермента находится в мономерном состоянии (>78%), не обнаруживая при этомкаких либо признаков междоменовой подвижности.
Напротив, при наличиифизиологических концентраций соли (200 мМ NaCl) значения Rg существенновозрастали (рис. 44В). Хотя доля димерной фракции (25%-35%) в зависимости отэкспериментальных условий увеличивалась незначительно, анализ полученныхрезультатов позволил предположить, что увеличение радиуса молекулы ферментапроисходило главным образом вследствие отдаления N-терминального домена откаталитического домена (рис. 44Г).7.2.3. Влияние лиганда на структуру и структурную подвижностьr12/15-LOX. Липоксигеназы обладают аллостерическими свойствами [150-152],однако механизмы аллостерического контроля остаются неизученными. Исходя изналичия равновесия в ряду мономер-димер можно предположить, что известныйаллостерический эффектор, 13(S)-H(p)ODE, индуцируя ряд конформационныхРис.
45. (А) Экспериментальные данные и модель, полученная на основелинейной комбинации мономера и димера r12/15-LOX, построенного попринципу P2-симметрии (черные точки и кривая 1), без лиганда и фермента вприсутствии лиганда (красные квадраты и кривая 2). Экспериментальныеданные скорректированы с учетом экспериментальных кривых МРР буфера, несодержащего фермент, а также буфера, содержащего 13(S)-HODE всоответствующих концентрациях.
(Б) Димерный интерфейс r12/15-LOX вкристалле (код 2P0M). (В) Сопоставление кристаллической структурымономера, димера и моделей, полученных на основе данных МРР.106изменений, приводит к сдвигу равновесия в сторону образования димерногокомплекса r12/15-LOX. С целью изучения возможности образования подобныхпереходных межмолекулярных ассоциаций r12/15-LOX под действием 13(S)H(p)ODE было исследовано влияние этого эффектора на размер и структуруассоциатов фермента в растворе с помощью метода МРР [279]. В присутствии 10кратного мольного избытка 13(S)-HODE наблюдалось увеличение Rg с 3,3±0,1 нмдо 4,2±0,1 нм, т.е. величине, которая близка к значению теоретического Rg (4,1 нм),рассчитанного для димера в кристалле (PDB идентификатор: 2P0M).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
