Диссертация (1090326), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Сравнениеэкспериментальных кривых показало заметное расхождение в области s<0,3 нм-1 исистематические отклонения в диапазоне величин s между 0,6 и 1 нм-1 (рис. 45А). Вотсутствии признаков неспецифической агрегации белков такое расхождениеможно объяснить как сдвигом равновесия в ряду мономер-димер, так иповышенной подвижностью N-концевого домена по отношению к каталитическомудомену, что в итоге приводит к увеличению радиуса вращения молекулы.Используя метод «твердого тела» [280] были получены структуры низкогоразрешения (30 Å), которые достаточно хорошо описывают экспериментальныеданные (рис. 45В).
В присутствии 10-кратного молярного избытка 13(S)-HODEобъемная доля димера увеличивалась с ~15 до 95%, предполагая, что лигандсдвигает равновесие ферментных фракций из мономерного практически полностьюв сторону димерного состояния. Как в случае мономера, так и димера, N-концевойдомен отодвигается от каталитической единицы, что приводит к значительномуувеличению радиуса частиц (рис. 45В). Этот результат согласуется с ранееполученными данными(разд. 5.1.2) и подтверждает возможность участияаминокислотных остатков междоменного интерфейса в процессах субстратногосвязывания. При более высоких концентрациях лиганда (40-кратный избыток)Таблица 15. Доля мономеров и димеров в водных растворах r12/15-LOX иW181E+H585E мутанта в присутствии лиганда.r12/15-LOXизбытоклиганда(моль)χ<Rg>(нм)объемнаяфракциямономера(%)объемнаяфракциядимера(%)01,383,3±0,18416401,094,5±0,12377модель димера (A:2–108|A:109–663, A:109–663|A:2–108) была получена в P2 симметрии помощьюна основе конформера A; фактор расхождения χ и объемные фракции были вычислены с помощьюпрограммы OLIGOMER [280]107объемная доля димера снижалась до 77% (табл.
15), что возможно в условияхобразования неустойчивых гомодимерных комплексов Б:Б, когда статистическиболее 50% молекул фермента содержат лиганд. Хотя при разрешении в 30 Åневозможноопределитьдетальноструктурныеэлементы,непосредственнововлеченные во взаимодействие двух молекул, полученные данные показываютналичие поверхностных изменений, происходящих на поверхности молекулыr12/15-LOX в присутствии лиганда (13(S)-HODE). При этом, 13(S)-HODE выступаетв роли молекулярного триггера, который сдвигает динамическое равновесие в рядумономер–димер между молекулами r12/15-LOX в водной среде в сторонуобразования переходного димерного комплекса.Наличиеконформационныхвзаимодействиислигандомизмененийвподтверждаютсямолекулетакжеr12/15-LOXисследованиямиприсприменением метода динамической флюоресценции [281]. Как было показаноранее, ширина распределений продолжительности эмиссии флуоресценцииотражает неоднородность микросреды, окружающей различные ароматическиеаминокислоты [89, 194].
В случае с r12/15-LOX взаимодействие этого фермента слипидным бислоем приводит к резкому изменению профиля распределенийпродолжительности эмиссии и вызывает увеличение ширины обоих компонентраспределения в случае, когда белок связан с поверхностью мембраны (рис. 46Б ивставка) [281]. Подобные изменения свидетельствуют о замедлении переходовмежду конформационными подсостояниями, что подтверждаются результатамиизмерений в системе, в которой присутствует глицерин, повышающий вязкостьраствора.Глицеринраспределений,индуцируетвоспроизводяростзначенийэффекты,шириныкоторыеобеихкомпонентнаблюдаютсяпривзаимодействии с липидной мембраной (рис. 46Б).
Напротив, присутствие всистеме ETYA (5,8,11,14-эйкозатетраиновой кислоты) (рис. 46А), ингибитора,который ковалентно связывается с r12/15-LOX и инактивирует ее [282], приводит кзначительному сужению распределений (-50%) обоих компонент (рис. 46А), то естьвызывает эффект, противоположный тому, который наблюдается в присутствиимембран и глицерина. Таким образом, в противоположность изменениям,происходящим в молекуле r12/15-LOX при взаимодействии с липидной мембраной,которое оказывает стабилизирующее действие на структуру r12/15-LOX, процесссвязыванияслигандом(ETYA)вызываетконформационными подсостояниями r12/15-LOX.108ускорениепереходовмеждуРис. 46. Короткая компонента распределения продолжительности эмиссиифлюоресценции: (A) водного раствора r12/15-LOX (сплошная линия, пустые квадраты)и r12/15-LOX в присутствии ETYA (пунктирная линия, заполненные квадраты); (Б)водного раствора r12/15-LOX в присутствии синтетической мембраны (пунктирнаялиния (длинные штрихи), заштрихованные квадраты) и r12/15-LOX в присутствииглицерина (пунктирная линия (короткие штрихи), черные квадраты).7.2.4.
Исследования интерфейса в димере r12/15-LOX с применениемметода МРР и направленного мутагенеза. В кристаллографическом димереr12/15-LOX Leu179, Leu183, Leu188 и Leu192 образуют гидрофобный кластер, в которомдва остатка лейцина, отдаленные друг от друга на виток одной 2-спирали,образуют непосредственный контакт с соответствующей парой антипараллельной2-спирали другого мономера (рис. 45Б). Такая организация напоминает мотивлейциновогозиппера[283,284],супрамолекулярнойструктуры,котораяфункционирует как димеризующий домен посредством генерации адгезионных сил109между индивидуальными мономерами. Также, Trp181 2-спирали конформера Авзаимодействует с остатком His585 18-спирали конформера Б, дополнительностабилизируя интерфейс [279].
В том случае, когда все эти гидрофобные элементывовлечены в межмолекулярную ассоциацию r12/15-LOX, индуцированную 13(S)HODE, введение заряженных аминокислотных остатков должно дестабилизироватьгидрофобный интерфейс и препятствовать димеризации. Для поиска наиболееподходящихкандидатовдляточечногомутагенезакаждыйизостатковгидрофобного интерфейса был заменен in silico на остатки 19-ти протеиногенныхаминокислот. Расчеты с использованием программы FoldX [286] показали, чтонаибольший вклад в энергию связывания димеров вносят а.о. Trp181, Leu183, Leu188,Ile194, Leu195 в конформере A и Trp181, Leu188 и Leu192 в конформере Б с ∆∆Gсвязывания в1,5 ккал/моль и выше (рис.
47). Расчеты с использованием программыРис. 47. Расчеты свободной энергии связывания в димере 12/15-LOX. Вкладиндивидуальных аминокислот в энергию связывания между конформером А (верхняяпанель) и конформером Б (нижняя панель) в димере (PDB 2P0M) 12/15-LOX. Расчетыпроводили с использованием программ FoldX [286] and Rosetta [287] как описано вэкспериментальной части.110Rosetta [287] привели к аналогичным. результатам, выделяя при этом вклад Trp181обоих конформеров в 3,0 ккал/моль, что также предполагает участие His585 встабилизации контактов между димерами.
На основе расчетов свободной энергиибыливыбраныдвекомбинацииаминокислот,длякоторыхотталкиваниемономеров показало наилучшие результаты (табл. 16) и с использованием методовгенной инженерии созданы соответствующие двойные мутанты (L183E+L192E иW181E+H585E).Таблица 16. Влияние мутации на свободную энергию взаимодействия мономеровr12/15-LOXМутантыFoldXRosetta∆∆G(ккал/моль)∆∆G (ккал/моль)W181E+H585E1,396,83L183E+L192E2,781,11Таблица 17. Доля мономеров и димеров в водном растворе W181E+H585Eмутанта в без лиганда и в его присутствиимутант W181E+H585Eизбытоклиганда(моль)χ<Rg>(нм)объемнаяфракциямономера(%)объемнаяфракциядимера (%)(%)01,153,2±0,18614401,013,4±0,17723фактор расхождения χ и объемные фракции, полученные для двух разных моделей мутантаL183E+L192E были вычислены с помощью программы OLIGOMER [280]В отличие от фермента дикого типа, для которого 13(S)-HODE вызываладимеризацию фермента (см. раздел 5.2.3), в случае мутанта W181E+H585Eэффект лиганда практически отсутствовал (рис.
48A) (табл. 17). Для мутантаL183E+L192E в отсутствии 13(S)-HODE было получено несколько большеезначение Rg=3,6±0,1 нм. Когда белок инкубировали с 13(S)-HODE, измененияэкспериментального профиля кривой МРР наблюдалось во всем диапазонезначений s от 0,1 нм-1 до 2,5 нм-1 (рис. 48Б). Анализ данных МРР для L183E+L192Eмутанта, связанного с лигандом, позволил определить величины Rg =4,3±0,1 нм и111Dмах=13±1 нм.
Хотя эти значения аналогичны тем, которые были получены длядимера фермента дикого типа в кристалле (4,1 нм), плато в диапазоне величин s от0,8 до 1,3 нм-1 предполагает, что молекулы мутанта L183E+L192E образуютассоциаты, отличающиеся по форме и молекулярной организации от ферментадикого типа (рис. 48Б). Ab inito модель предполагает объем ассоциата равный480±10 нм3, что в 2,5 раза превышает объем димера (2P0M: 190 нм3). Оценкамолекулярной массы приводит к величине в 230±10 кДа, значению, которое в 3Рис.
48. (А) Экспериментальные данные и модель полученная на основелинейной комбинации мономера и димера (P2-симметрия) W181E+H585E (черныеточки и линия 1) без лиганда и фермента в присутствии 40-кратного молярногоизбытка 13(S)-HODE (красные точки и линия 2). (Б) Экспериментальные данные имодель, полученная на основе линейной комбинации мономера и тетрамераL183E+L192E в P222 симметрии (черные точки и линия 1) без лиганда и ферментав присутствии 40-кратного молярного избытка 13(S)-HODE (красные точки илиния. Экспериментальные данные скорректированы с учетом эксперимен-тальныхкривых МРР для буфера, не содержащего фермент, а также буфера, содержащего13(S)-HODE в соответствующих концентрациях.
(В) Модели тетрамера комплексамутанта L183E +L192E с 13(S)-HODE в P222 симметрии.112разапревышаетмассумономераr12/15-LOX(75кДа).Этирезультатысвидетельствуют о том, что фермент находится в олигомерном состоянии в видетримера или тетрамера. Попытки создать устойчивую модель тримера не имелиуспеха, в то время как модель тетрамера, содержащая мономеры r12/15-LOX вкачествесубъединицвP222симметриипрактическиидеально(факторрасхождения χ=1,08) описывала экспериментальные данные (рис. 48Б).
ЗначениеRg, определенное для мутанта L183E+L192E в отсутствие лиганда, превосходиловеличину Rg фермента дикого типа. Предполагая наличие равновесия в рядумономер–димер, это несоответствие можно объяснить как увеличением долидимеров на ~30% (χ=1,16) (табл. 18), с одной стороны, так и присутствием 10%тетрамеров вмономерной фракции (90%)(χ=1,23),с другой.С учетомпредположения, что введение мутаций способствует отталкиванию мономеров,использованиедимерноймоделивданномслучаеТаблица 18. Доля мономеров и олигомеров вL183E+L192E мутанта без лиганда и в его присутствиимономер-димераизбытоклиганда(моль)040χвобъемнаяфракциямономера (%)становитсяводноммалорастворемономер-тетрамербобъемнаяфракциядимера (%)χобъемнаяфракциямономера (%)объемнаяфракциятетрамера (%)1,1671291,23919---1,0877100амодельдимера (A:2–108|A:109–663, A:109–663|A:2–108) была получена в P2 симметриипомощью на основе конформера Aбмодель тетрамера L183E+L192E мутанта была получена в P222 симметрии с использованиемпрограммы SASREF [278]вфактор расхождения χ и объемные фракции, полученные для двух разных моделей мутантаL183E+L192E были вычислены с помощью программы OLIGOMER [280]приемлемым.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
