Диссертация (1090326), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Полученные кривыеописываются одним уравнением, предполагая, что кинетика денатурации каквторичной, так и третичной структуры белка совпадает.[270]. Если для R403L ширина короткой компоненты возрастала в диапазонетемператур от 10 до 30°С, отражая повышенную разнородность системы, то дляфермента дикого типа наблюдался противоположный эффект. При температурахвыше 40°С, когда оба белка находятся на стадии, предшествующей денатурации,ширина распределения короткой компоненты продолжительности эмиссии дляфермента дикого типа увеличивалась, а для мутантаR403L оставаласьпрактически неизменной (рис. 38А и 38Б).
Эти данные позволяют предположить,что замена Arg403 на Leu индуцирует повышенную чувствительность третичной94структуры мутанта к изменениям температуры.Хотяструктурные основынаблюдаемых изменений при температурах ниже 30°С остаются невыясненными,они изначально могут быть связаны с повышенной степенью гидратацииструктурных элементов белка в области мутации.Дляпроверкиданнойгипотезыбылоисследованоизменениефлуоресцентных свойств r12/15-LOX вследствие мутации R403L как функциидавления.Повышениедавлениявсистемеможетзаставитьмолекулырастворителя глубже проникать в белок, повышая гидрофильность окруженияостатков Trp, понижая тем самым интенсивность эмиссии флуоресценции. ДляферментадикогофлуоресценциитипаTrp)имутантапредставляетсмещениесобойцентракривуюсмассдвумя(максимумапереходнымисостояниями и плато между двумя регионами наиболее выраженных изменений(показано стрелками), индуцированных повышением давления (рис.
38В). Принизких температурах (20°С) кривые перехода обоих белков практически неотличаются, тогда как при 40°С – температуре – которая соответствует среднейточке перехода вторичной структуры белка (рис. 38В), мутант проявляетнаибольшую конформационную разнородность. Сдвиг плато (рис. 38В, отмеченострелкой) с величин в 1000-1500 бар (фермент дикого типа) в диапазон болеенизкого давления (500-1000 бар; рис. 38В, стрелка со звездочкой) позволяетпредположить, что изменения в третичной структуре мутанта требуют меньшеэнергии на первой стадии перехода. Эти данные согласуются с изменениямикороткой компоненты продолжительности эмиссии флуоресценции и подтверждаютранее высказанное предположение о том, что третичная структура мутанта можетбыть частично дестабилизирована из-за повышенного воздействия молекулрастворителя на его структурные элементы.
Данная гипотеза подтверждаетсяисследованиями по денатурации r12/15-LOX и ее мутанта под действием GdnHCl.Так как GdnHCl способен вступать во взаимодействие с пептидными связями,структурные элементы белка, имеющие непосредственный контакт с молекуламирастворителя, наиболее подвержены влиянию его воздействия [271]. Кривыеденатурации LOX включают два переходных состояния в области концентрацийGdnHCl между 0,7 и 1,5 М, а также 2,0 и 3,0 М GdnHCl, и содержат плато в оластиконцентрацийGdnHCl1,5-2,0М.Подобныйпрофилькривыхпозволяетпредположить, что денатурация фермента может быть описана с помощью модели,предусматривающей наличие 3-х основных состояний (M↔I↔U), в которойсостояние M нативная конформация белка, I частично денатурированный белок и Uполностью денатурированный белок.
Аналогичная модель была представлена дляLOX1 сои [272]. Анализ кривой денатурации (рис. 38Г) позволяет определить95Таблица 11. Термодинамические параметры денатурации r12/15-LOX имутантовпереход состояния M IБелокпереход состояния I UG1ккал/мольm1ккал/(моль M)G2ккал/мольm2ккал/(моль M)r12/15-LOX11,7±0,611,1±0,53,2±0,21,4±0,1R403L мутант4,6±0,22,5±0,15,0±0,31,2±0,1каталитическийдомен3,4±0,23,3±0,24,3±0,21,6±0,1свободную энергию ΔG1 первого перехода (M↔I) в 11,7±0,6 ккал/моль (табл.
11).Оценочное значение свободной энергии второго перехода (I↔U) составляет 25%от этой величины (ΔG2=3,2±0,2 ккал/моль). Напротив, для мутанта R403Lсвободная энергия для первого перехода ΔG1 составляет лишь 30% (4,6±0,2ккал/моль) от величины ΔG1, полученной для фермента дикого типа. При этомзначения свободной энергии второго переходного состояния не отличаются сильнодруг от друга (3,2 ккал/моль для r12/15-LOX и 5,0 ккал/моль для мутанта R403L).Интересно, что для перехода M↔I так называемой mini-LOX (изолированного Сконцевого домена r12/15-LOX) значение ΔG1 (3,4±0,2 ккал/моль) сопоставимо созначением ΔG1 (4,60±0,2 ккал/моль) для мутанта R403L. Представленные данныепоказывают, что как мутанту R403L, так и С-концевому каталитическому доменутребуется меньше энергии для конформационного перехода из их основныхсостояний М в промежуточное состояние I.
Таким образом, по сравнению сферментом дикоготипаобамодифицированныхбелкамогутизначальноприсутствовать в более гидратированном состоянии. Этот вывод дополнительноподтверждается и анализом величин m [273, 274], которые находятся в строгойкорреляции с изменением площади поверхности доступной растворителю (ΔASA) впроцессе денатурации белка. Параметры m, рассчитанные по кривым переходаmini-LOX и мутанта R403L, 2,5±0,1 и 3,3±0,2 ккал/моль М, соответственно, в 3-4раза ниже значения m, рассчитанного для фермента дикого типа (11,1±0,5ккал/моль М).7.1.7.
Функциональная роль Arg403 в структуре r12/15-LOX. Замена Arg403на Leu в r12/15-LOX человека приводит к существенному понижению каккаталитической активности фермента, так и его сродства к АК и ЛК [266].Аналогичныерезультатыбылиполучены96ранееприиспользованиирекомбинантных препаратов LOX (мутанта R403L и r12/15-LOX), экспремированныхв клетках насекомых [267]. Молекулы LOX млекопитающих имеют достаточногибкую белковую матрицу и, следовательно, могут образовывать олигомеры приизменении как их внутренних свойств вследствие мутации [254], так и свойствокружающей их среды [196, 259].
Для изучения влияния структурных изменений,вызванных мутацией, на свойства фермента были выделены фракции мутантаРис. 39. Кинетические кривые окисления ПНЖК рекомбинантной r12/15-LOX и еемутантом R403L. Кривые представляют собой зависимость скорости образованиясопряженного диенового хромофора (235 нм) от концентрации субстрата.Концентрация фермента в реакционной смеси (56 нмоль) была скорректирована сучетом содержания железа.97R403L, которые не проявляли признаков неспецифической олигомеризации. Вотличие от фермента дикого типа, который окисляет ЛК и AК в диапазонеконцентраций от 2 до 80 мкМ по механизму, описываемому уравнениемМихаэлиса-Ментена,длямутантаR403LбылообнаруженосубстратноеТаблица 12. Кинетические параметры окисления ПНЖК r12/15-LOX и мутантомR403LМутант R403Lr12/15-LOXСубстратkcat/KM*(c-1мкM-1)KM*(мкM)kcat/KM*(с-1мкM-1)KM*(мкM)ЛК2,65±0,2616,9±2,60,83±0,09a28,1±7,5АК1,41±0,178,2±1,451,95±0.33b10,9±3,8Me-AК0,76±0,2318,6±7,40,17±0,03c11,4±3,1aрасчитанодля диапазона концентраций 0-25µM ЛКдля диапазона концентраций 0-15µM AКcрасчитано для диапазона концентраций 0-50µM Me-AКbрасчитаноингибирование даже в области низких концентраций ПНЖК (15-25 мкм) (рис.
39). Вслучаеr12/15-LOXдикоготипазначениявеличинKM*икаталитическойэффективности (kcat/Км ) составляли 8,2 / 16,9 мкМ и 1,41±0,17 / 2,65 ± 0,26 с-1 мкМ-1*для АК и ЛК, соответственно (табл. 12). Эти значения согласуются с ранееопубликованными данными для препаратов нативной и рекомбинантной r12/15LOX [106, 242, 267]. Для количественной оценки каталитических свойств мутантаR403L был проведен анализ экспериментальных данных в диапазоне концентрацийсубстрата, где кинетика ферментативной реакции может быть в приближенииописана уравнением Михаэлиса-Ментена.
Каталитическая эффективность (kcat/Км*)мутанта R403L при окислении ЛК значительно ухудшалась вследствии мутации, вто время как эффективность окисления АК оставалась практически без изменений.Метилирование карбоксильной группы АК, в свою очередь, приводило к резкомупонижению эффективности окисления модифицированного субстрата мутантомR403L (рис. 39В, табл.
12) [270]. Интересно отметить, что использованиеметилового эфира АК (Ме-АК) также индуцирует ингибирование мутанта R403L, нотолько при более высоких концентрациях субстрата (выше 100 мкм). Кинетическиеисследования показывают, что по сравнению с ферментом дикого типа, заменаArg403 на нейтральный Leu приводит к уменьшению каталитической эффективностиокисления ЛК более чем в 3 раза, что находится в соответствии с ранееполученнымирезультатами,предполагающими98участиеArg403впроцессесвязывания ПНЖК [266].
Напротив, при окислении АК замена Arg403 на Leuсущественно не влияет ни на позиционную специфичность фермента [267], ни наэффективность ферментативного катализа (1,41±0,17 с-1 мкМ-1 для ферментадикого типа против 1,95±0,33 с-1 мкМ-1 для мутанта, табл. 12). Эти данные всочетании с результатами моделирования [119, 120] показывают, что, хотя Arg403 иможет быть вовлечен в процесс связывания с карбоксильной группой ПНЖК, вслучае с АК остаток Arg403 играет менее выраженную роль в ее позиционированиив полости субстрат связывающего кармана фермента. Анализ структуры ферментаРис. 40. Электростатический потенциал r12/15-LOX кролика.
Области наибольшегосродства к отрицательно заряженным группам выделены синим цветом, краснымцветом обозначены области наибольшего сродства к положительно заряженнымгруппам, белым цветом обозначены гидрофобные области.показывает наличие других положительно заряженных остатков (Arg166, Lys172) внепосредственной близости от Arg403. Эти остатки образуют положительныйпотенциал, слагаемый суммой диполей элементов полипептидной цепи, которыйможет оказывать влияние на ориентацию субстрата в процессе ферментсубстратного связывания даже в отсутствии Arg403 (рис.
40) [270].r12/15-LOXпроявляетпоотношениюкАКдвойнуюпозиционнуюспецифичность, при которой хиральные продукты реакции окисления [15(S)-HpETEи 12(S)-HpETE] могут образовываться одновременно [1, 99]. Как для ферментадикого типа, так и его мутанта, 15(S)-H(р)ETE является основным продуктом, в товремя как вклад 12(S)-H(р)ETE в общую долю ферментативных продуктовнезначителен [106, 267]. При исследовании полученных нами препаратов r12/15LOX и мутанта R403L на долю 15(S)-H(р)ETE приходилось >95% и ~90% от общего99Рис. 41.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
