Диссертация (1090326), страница 30

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 30)

В обоих случаяхиспользовалась скорость элюента в 1 мл/мин. Хроматомасс-спектрометрическийанализ продуктов окисления соединений 22, 23, 33, 34 проводили по методикеописанной в разделе Материалы и методы к главе 5.Структурноемоделированиекомплексафермент-субстрат.Моделькомплекса r12/15-LOX с субстратом была создана на основе кристаллическойструктуры r12/15-LOX ретикулоцитов кролика [24] (PDB 1LOX). Недостающие а.о.601-602, 210-211 и 177-187, а также субстрат – 16(S)-HETE были помещены вмолекулуферментаспомощьюпрограммыVMD[297]споследующейминимизацией энергии с помощью программы NAMD [233].Методики к разделу 5.2Изучение ингибиторной активности соединений 48-52.

Для измеренияостаточной активности рекомбинантных препаратов r12/15-LOX при окислении ЛКилиАКкислотиспользовалиэлектродКларка.Ферментпредварительноинкубировали в течение 30 с в присутствии различных концентраций ингибитора в0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) и реакцию инициировали добавлениемметанольного раствора ПНЖК (150 мМ ЛК или 200 мМ АК). Все измеренияпроводили при комнатной температуре. Для количественного определенияингибиторнойактивностивклеточныхсистемахклетки(106клеток)ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (0,5 мл) и инкубировали сингибитором (различные концентрации) в течение 2 мин. Реакцию инициировалидобавлением ЛК (100 мМ) и выдерживали при 15 мин при комнатной температуре.Гидропероксиды ПНЖК восстанавливали до соответствующих гидроксильныхпроизводных добавлением 5-ти молярного избытка боргидрида натрия, смесьподкисяли до рН 3, прибавляли метанол (0,5 мл), твердый остаток осаждалицентрифугированием и аликвоты (100 мкл) анализировали методом ВЭЖХ пометодике, описанной в разделе 5.1.1.Структурное моделирование комплекса фермент-ингибитор.

Модель,описывающая взаимодействие двух геометрических изомеров BODTCM (48а и 48b)с активным центром r12/15-LOX кролика была построена с использованием157экспериментальных данных, описывающих взаимодействие фермента с эбселеном[223, 224]. Минимизация энергии с помощью программы DS-Viewer Pro 6.0(Accelrys, США) показала наличие плоской структуры BODTCM в комплексе сr12/15-LOX, что согласуется с ранее опубликованными данными [298]. Полученнуютаким образом структуру BODTCM накладывали на молекулу эбселена в комплексеr12/15-LOX–эбселен, совмещая при этом атомы серы и селена [224]. Молекулу (Е)BODTCM поворачивали вокруг атома серы, сохраняя при этом планарностьструктуры ингибитора, до тех пор, пока не возникали стерические затруднения засчет столкновения с аминокислотными остатками белка. Для Z-изомера былообнаружено наличие стерических ограничений из-за взаимодействия с боковойцепью Ile663, который принадлежит к первой координационной сфере железа [31].Восстановление Fe (III).

Способность соединений 49-52 восстановивать Fe(III) измеряли по методике Дюпона [238] в присутствии ферроцина, которыйобразует комплекс с Fe (II), обладающий высоким коэффициентом экстинкции при562нм.Реакционнаясмесьсодержала50мМраствор-морфолинопропансульфоновой кислоты (рН 2,0), 1 мМ раствор ферроцина, 50 мМраствор тестируемого соединения и 100 мM FeCl3 в конечном объеме 1 мл.Реакцию начинали добавлением FeCl3, после чего контролировали и изменениеоптической плотности при 562 нм в течение 10 мин.158Эксперимент к главе 6Материалы и общие методыМатериалы, использованные в работе, методы выделения природной r12/15LOX кролика, клонирования, выделения и очистки рекомбинантной r12/15-LOX и еемутантов описаны в экспериментальной части к главе 5.Методики к разделу 6.1Кинетические исследования.

Кинетику реакции природной r12/15-LOXкролика контролировали либо спектрофотометрически, измеряя поглощение УФпри 234 нм, либо оксиграфически с помощью кислородного электрода Кларка. Дляфотометрических измерений был использован спектрофотометр Shimadzu UV2100.Реакционную смесь фосфатный буфер (1 мл, 0,1 М, рН 7,4), содержащийразличные концентрации субстрата (44b или 44c) и/или кислорода.

Ферментпредварительно инкубировали в буфере в течение примерно 10 сек в присутствииактиватора (13(S)-HрODE, 2 мкм), и реакцию инициировали добавлением аликвотыраствора субстрата. Для сведения к минимуму воздействия суицидальнойинактивацииреакциюпроводилипри20 oС.Концентрациюкислородаустанавливали путем смешения аликвот реакционного буфера, полученногомногократным вакуумированием и промывкой аргоном, с буфером, насыщеннымкислородом.StrathkelvinДля781оксиграфических(StrathkelvinизмеренийInstruments,былиспользованВеликобритания).Приоксиграфобъемереакционной смеси 0,4 мл, состав реакционной смеси был аналогичен составу,использованному при спектрофотометрических исследованиях.

Шкалу оксиграфакалибровали с использованием NADH.Анализпродуктовокисления.Продуктыферментативнойреакциивыделяли, как описано в методике к разделу 5.1.1. Анализ ВЭЖХ производныхПНЖК осуществляли на обращенной и прямой фазах в системах растворителейМеОН/Н2О/СН3СООН (75:25:0,1 по объему) и н-гексан/2-пропанол/СН3СООН(98:2:0,1, по объему), соответственно.Методики к разделу 6.2Кинетическое моделирование. Для вывода уравнений скорости былопринято допущение, предполагающее, что в условиях эксперимента связыванием2+субстрата (S) с неактивной формой фермента (EFe и связыванием гидроперокси159производных жирных кислот (продукт реакции (SOOH) или экзогенно добавленный3+активатор AOOH)) с активной формой фермента (EFe ) можно пренебречь.3+Учитывая связывание субстрата (S) с ферментом (EFe ) и связывание пероксидов2+SOOH или активатора AOOH с неактивной формой фермента (EFe ) общая суммафракций фермента может быть представлена в виде нескольких пулов:2+2+2+X1 = EFe + EFe -AOOH + EFe -SOOH(1)3+3+X2 = EFe + EFe -SX3 = ES•X4 = ESOO•,которые складываются в значение Eo = X1 + X2 + X3 + X4.Кинетические уравнения, описывающие временную зависимость концентрацииреагентов и пулов фермента может быть выражена с помощью двух системуравнений (2) и (3):d(S) f2 (X2 )dtd(O2) f4 (X3 )  k r (O2)[(SO)  (AO)]dtd(SOOH) [f5  f6 ](X4 )  f3 (X3 )  f1P (X1 )  f1P (X 2 )dtd(AOOH) f1A (X1 )  f1A (X2 )dtd(SO) f1P (X1 )  [f1P (X 2 )  k r (O 2)  k r* ](SO)dtd(AO) f1A (X1 )  [f1A (X 2)  k r (O 2)  k r* ](AO)dtd(O2 )* k r (O2 )[(SO)  (AO)]  k PS(O 2)(X 2 )dt(2)иd(X1) f3 (X3 )  f6 (X4 )  [f1P  f1A ](X1 )  [f1P  f1A ](X 2 )dtd(X2 ) [f1P  f1A ](X1 )  [f1P  f1A ](X 2 )  f5 (X 4 )  f2 (X 2 )dtd(X3) f2 (X2 )  [f3  f4 ](X3 )dtd(X4 ) f4 (X3 )  [f5  f6 ](X 4 )dt160(3)В системе уравнений (2) переменные (SO•) и (АО•) обозначают алкоксильныерадикалы, образующиеся в результате гомолитического разрыва перекисной связив продукте окисления 19-НЕТЕ (SOOH на схеме 9, который действует какэндогенный активатор фермента) и в 13(S)-HрODE (AOOH на схеме 9), которыйявляется экзогенным активатором.

Функции скорости f1P, f1H, f-1P, f-1H, f2, f3, f4 , f5, f6 иf7, входящие в системы уравнений (2) и (3) могут быть описаны как:f1P k P (SOOH)K PM (1  (AOOH) / K AM )  (SOOH)f1A k  A (AOOH)K AM (1  (SOOH) / K PM )  (AOOH)f1P k P (SO)1  (S) / K SMf1A k  A (AO)1  (S) / K SMf2 k h (S)K SM  S(4)*f3  kPS  k PS(O2 )f4  k O (O2 )f5  kPO*f6  kPOKPM и KAM представляют собой константы связывания ферментативного продукта(эндогенного активатора) и экзогенного активатора 13(S)-HрPODE с неактивной2+формой фермента (EFe ), тогда как KSM – константу связывания субстрата (S) с3+активной формой фермента (EFe ).Кинетические уравнения (2) - (4) определяют концентрации переменных наоснове законов кинетики химических реакций. Так, в случае, когда, концентрациякислорода (О2) уменьшается в процессе липоксигеназной возможно протекание 3-хнезависимых реакций: (I) реакции кислорода с комплексом фермент-радикал (Е2+S•), которая представляет собой бимолекулярную реакцию, характеризющуюсяконстантойскорости2+ko(O2)(EFe -S•);(II)реакциикислородаспродуктом,алкоксильным радикалом (SO•), образующимся в процессе активации ферментапродуктом реакции, которая характеризуется скоростью kr(O2)(SO•); и (III) реакциикислорода с экзогенным активатором – алкоксильным радикалом (AO•).

Скоростьэтихтрехэлементарныхпроцессовпредставленыввидесистемыдифференциальных уравнений (2). Следует отметить, что для определения161функцийскоростиконцентрация(4)былоалкоксильныхсделанорадикаловдопущение,значительнопредполагающие,нижечтосоответствующихконстант диссоциации комплекса фермент-радикал. Таким образом, в течениекороткого промежутка времени, определяемого наименьшей функцией скорости (f1P, f1A, f-1P , f-1A, f2, f3, f4, f5, f6, kr, kr*), устанавливается квази-стационарное состояние,при котором временные производные для различных пулов фермента (Xi) ипромежуточных продуктов реакции (SO•) и (АО•) приближаются к нулю:d(X1) 0 (i = 1,2,3,4)dt(5.1)d(SO) d(AO)0dtdt(5.2)Решение алгебраической системы уравнений (5.1) приводит к:(6)(Xi) = Ci (X) / (C1 + C2 + C3 + C4),где(C1 )  [f1P (SO)  f1A (AO)][f3  f4 ]  [f2 f3 ] [f5  f6 ]  f2f4f6(C2 )  (f1P  f1A )(f3  f4 )(f5  f6 )(7)(C3 )  (f1P  f1A )f2 (f5  f6 )(C4 )  (f1P  f1A )f2 f4В условиях квази–стационарного состояния, выраженного уравнениями (5.1) и (5.2),последние два уравнения системы (7) можно представить в следующем виде:(SO) f1P (X1 )f1P (X2)  k r (O2)  k r*(8)f1A (X1 )(AO) f1A (X2 )  k r (O2)  k r*Уравнения (8) представляют собой самосогласованные уравнения типа y = f(y) поотношению к переменным SO• и АО•, поскольку переменная С1 и, таким образом,пул переменных X1 и X2 зависят от (SO•) и (АО•) в соответствии с уравнением (6).Система уравнений (8) решается с помощью итерационного метода yn = f(yn-1),n=1,2,…Кинетические уравнения, определяющие временную зависимостьконцентрации субстрата, кислорода, гидропероксидов (эндогенный активатора) и13(S)-H(р)ODE (экзогенный активатора) можно представить в виде:162d(S)dtd(O 2 )dtd(SOOH)dtd(AOOH)dtd(O 2 )dt  vS  vO vP(9)  vH vORгде уравнения скорости стационарного состояния vO, vS, vP, vH и vor определяютсяследующим образом:vO  f4 (X3 )  k r (O2)[(SO)  (AO)]vS  f2 (X 2 )vP  (f5  f6 )(X4 )  f1P (X1 )  f1P (X 2 )(10)vH   f1A (X1 )  f1A (X 2 )*vOR  k r [(AO)  (SO)](O 2 )  k PS(X3)(O 2 )При этом следует отметить, что концентрации алкоксильных радикалов (SО•) и(АО•), входящих в уравнения скорости (10), рассчитываются на основанииуравнений (8) с помощью итерационной процедуры.

Характеристики

Список файлов диссертации