Диссертация (1090326), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Кодирующий регион выделен цветом. ATG и TGA–START- и STOP-кодоны, соответственно [319]179ПРИЛОЖЕНИЕ 3.Структура вектора pQE-9180ПРИЛОЖЕНИЕ 4.Мутация: I14KОлигонуклеотиды:5′-ACC-ggg-gCC-TCg-AAA-TAC-gCg-ggC-TCC5′-ggA-gCC-CgC-CgA-TTT-CgA-ggC-CCC-ggTМутация: Y98АОлигонуклеотиды:5′-Tgg-TTC-CCg-TgC-gCg-CgC-Tgg-gTg-gTg5’-CAC-CAC-CCA-gCg-CgC-gCA-Cgg-gAA-CCAМутация: Y98EОлигонуклеотиды:5′-Tgg-TTC-CCg-TgC-gAg-CgC-Tgg-gTg-gTg5′-CAC-CAC-CCA-gCg-CTC-gCA-Cgg-gAA-CCAМутация: Y98FОлигонуклеотиды:5′-Tgg-TTC-CCg-TgC-TTC-CgC-Tgg-gTg-gTg5′-CAC-CAC-CCA-gCg-gAA-gCA-Cgg-gAA-CCAМутация: Y98RОлигонуклеотиды:5′-Tgg-TTC-CCg-TgC-Cgg-CgC-Tgg-gTg-gTg5′-CAC-CAC-CCA-gCg-gCC-gCA-Cgg-gAA-CCAМутация: W181EОлигонуклеотиды:5′-gCT-TCg-CTg-gCC-gAg-ggg-CTg-gCA-gAg5′-CTC-TgC-CAg-CCC-CTC-ggC-CAg-CgA-AgCМутация: L183EОлигонуклеотиды:5’-CTg-gCC-Tgg-ggg-gAg-gCA-gAg-CTC-gCT5’-AgC-gAg-CTC-TgC-CTC-CCC-CCA-ggC-CAg181Мутация: L192ЕОлигонуклеотиды:5’-TTg-AAg-gAC-TCg-gAg-AAT-gTT-CTg-gCT5’-AgC-CAg-AAC-ATT-CTC-CgA-gTC-CTT-CAAМутация: F353LОлигонуклеотиды:5’-CgT-AgC-TCT-gAC-CTC-CAg-gTT-CAT-gAg5’-CTC-ATG-AAC-CTg-gAg-gTC-AgA-gCT-ACgМутация: L367EОлигонуклеотиды:5’-CTg-Agg-ggA-CAC-gAg-ATg-gCC-gAg-gTC5’-gAc-CTC-ggC-CAT-CTC-gTg-TCC-CCT-CAgМутация: L367FОлигонуклеотиды:5’-CTg-Agg-ggA-CAC-TTT-ATg-gCC-gAg-gTC5’-gAc-CTC-ggC-CAT-AAA-gTg-TCC-CCT-CAgМутация: L367KОлигонуклеотиды:5’-CTg-Agg-ggA-CAC-AAg-ATg-gCC-gAg-gTC5’-gAc-CTC-ggC-CAT-CTT-gTg-TCC-CCT-CAgМутация: L367WОлигонуклеотиды:5’-CTg-Agg-ggA-CAC-gAg-ATg-gCC-gAg-gTC5’-gAc-CTC-ggC-CAT-CTC-gTg-TCC-CCT-CAgМутация: R403LОлигонуклеотиды:5’-gAg-ATC-AAC-gTC-CTg-gCC-Agg-AAC-ggg5’-CCC-gTT-CCT-ggC-CAg-gAC-gTT-gAT-CTCМутация: Q548LОлигонуклеотиды:5’-ATC-CAC-CTg-ggC-gAg-TTg-gAC-Tgg-TTC5’-gAA-CCA-gTC-CAA-CTC-gCC-CAg-gTg-gAT182Мутация: H585EОлигонуклеотиды:5′-CTg-CCC-AAC-TTg-gAg-CAg-TCT-TCT-CTC5′-gAg-AgA-AgA-CTg-CTC-CAA-gTT-ggg-CAgМутация: Q596AОлигонуклеотиды:5′-TCC-ATC-gTC-Tgg-gCg-CTA-ggC-Agg-gAC5′-gTC-CCT-gCC-TAg-CAC-CCA-gAC-gAT-ggAМутация: Q596LОлигонуклеотиды:5′-TCC-ATC-gTC-Tgg-CTg-CTA-ggC-Agg-gAC5′-gTC-CCT-gCC-TAg-CAg-CCA-gAC-gAT-ggAМутация: Y614RОлигонуклеотиды:5′-CAC-CAg-gAg-gAg-CgC-TTC-TCg-ggC-CCT5′-Agg-gCC-CgA-gAA-gCg-CTC-CTC-CTg-gTgСтруктура использованных в работе олигонуклиотидов183ПРИЛОЖЕНИЕ 5Структура комплекса r12/15-LOX кролика с АК184ПРИЛОЖЕНИЕ 6Идентификация энергитических барьеров и вероятность нахождения кислорода185ПРИЛОЖЕНИЕ 7.Анионообменная хроматография r12/15-LOX а колонке ResourceQ 6 мл (GE Healthcare,Швеция).
Вставка: SDS-ПААГ электрофорез объединенных фракций186ПРИЛОЖЕНИЕ 8.Гель-фильтрация r12/15-LOX на колонке SuperdexTM 200 10/300 GL. Вставка: SDSПААГ электрофорез объединенных фракций187ПРИЛОЖЕНИЕ 9.1.2.3.4.5.6.r12/15-LOX (рН 6,8)r12/15-LOX(рН 8,0)W181E+H585E (рН 6,8)W181E+H585E (рН 8,0)L183E+L192E(рН 6,8)L183E+L192E(рН 8,0)SDS-ПААГ электрофорез объединенных фракций рекомбинантной r12/15-LOX дикоготипа и мутантов после очистки188СПИСОК СОКРАЩЕНИЙАК – арахидоновая кислота,АПК – аминокислотная последовательность,а.о.
– аминокислотные остатки,Bz – бензоил,BODTCM – метилоый эфир 2-бензилиден-3-оксо-2,3-дигидробензо[b]тиофен-7-карбоновой кислоты,БСА – бычий сывороточный альбумин,BSTFA – бис(триметилсилил)трифторацетамид,КД – круговой дихроизм,ГЛА – гомо--линоленовая кислота,ДМФА – диметилформамид,dNTPS – дезоксирибонуклеозидтрифосфатыDTT – дитиотриэтол,ЕТЕ – (5Z,8Z,11Z,14Z)-эйсоза-5,8,11,14-тетраеновая кислота,ЕТYA – 5,8,11,14-эйкозатетраиновая кислотаНЕТЕ – (5Z,8Z,11Z,14Z)-гидроксиэйсоза-5,8,11,14-тетраениновая кислота,13(S)-H(p)ODE – (13S,9Z,12Z)-13-гидро(перо)ксиоктадека-9,12-диеновая кислота,15(S)-H(p)ЕТE– (15S,5Z,8Z,11Z,13Е)-15-гидро(перо)ксиэйсоза-5,8,11,13тетраениновая кислота,GdnHCl – гуанидин гидрохлорид,rac-16-HETE – rac-(5Z,8Z,11Z,14Z)-16-гидроксиэйкоза-5,8,11,14-тетраеноваякислота,16(S)-HETE – (16S,5Z,8Z,11Z,14Z)-16-гидроксиэйкоза-5,8,11,14-тетраеновоаякислота,16(R)-HETE – (16R,5Z,8Z,11Z,14Z)-16-гидроксиэйкоза-5,8,11,14-тетраеноваякислота,17(S)-HETE – (17S,5Z,8Z,11Z,14Z)-17-гидроксиэйкоза-5,8,11,14-тетраеновоаякислота,18917(R)-HETE – (17R,5Z,8Z,11Z,14Z)-17-гидроксиэйкоза-5,8,11,14-тетраеноваякислота,rac-18-HETE – rac-(5Z,8Z,11Z,14Z)-18-гидроксиэйкоза-5,8,11,14-тетраеноваякислота,rac-19-HETE – rac-(5Z,8Z,11Z,14Z)-19-гидроксиэйкоза-5,8,11,14-тетраеноваякислота,20-HETE – (5Z,8Z,11Z,14Z)-20-Гидроксиэйкоза-5,8,11,14-тетраеновая кислота,HEPES – (2-(4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил)-этансульфоновая кислота,HMPA – гексаметилтриамид фосфорной кислоты,IPTG – изопропил-1-тио--D-тиогалактопиранози,LOX – липоксигеназа,r12/15-LOX – 12/15-липоксигеназа кролика,h12/15-LOX – 12/15-липоксигеназа человека,ЛА – линолевая кислота,МРР – малоугловое рентгеновское рассеяние,PААГ – полиакриламидный гель,PDB – банк данных 3-D структур белков и нуклеиновых кислот;PFB – пентафторбензол,ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты,pss – фотостационарное состояние,ПЦР – полимеразная цепная рефкция,TMS – триметилсилил,ТГФ – терагидрофуран,ТЕМЕД – тетраметилендиамин,Ts – п-толуолсульфонил,ТФК – трифторуксусная кислота,МРР – малоугловое рентгеновское рассеяние,SDS – додецилсульфат натрия.190БЛАГОДАРНОСТИВ заключение автор хотел бы поблагодарить всех соавторов публикаций потеме диссертации, которые принимали непосредственное участие в реализацииэкспериментальной части данной работы.
Это, прежде всего, кандидат химическихнаук Н. В. Гроза, доктора А. Ди Венере (Dott. A. Di Venere), Л. Масграу (Dott. L.Masgrau), Р. Виезнер (Dr. rer. nat. R. Wiesner), Я. Саам (Dr. rer. nat. J. Saam), В.Шанг (Dr. rer. nat. W. Shang), а также С. Г. Романов.Этаработа,исследованиеикотораявлючаетвпредставляетсебямногиесобойметодымультидисциплинарноебиохимии,биофизики,молекулярной и структурной биологии, выполнялась в течение длительноговремени сучастием различных исследовательских групп и лабораторий, общееруководство которыми осуществляли опытные коллеги.
Невозможно переоценитьподдержку проф. Г.И. Мягковой (Институт тонких химических технологий ФГБОУ ВОМосковский технологический университет) и проф. Х. Кюна (Н. Kühn, Институтбиохимии Медицинского университета Charité, г. Берлин, Германия), которых авторимеет честь считать своими учителями, и благодарит за их непосредственноеучастие на всех этапах подготовки диссертации.Автор крайне признателен академику Н. Ф. Мясоедову (ФГБУН Институтмолекулярной генетики РАН) за предоставленную возможность проведенияэкспериментов по ведению радиоактивной метки, а также за организациюпроведения экспериментов с животными по выделению природной 12/15липоксигеназы кролика; проф. Х.
Г. Хольцхюттеру (H.-G. Holzhütter, группабиофизики, Институт биохимии Медицинского университета Charité, Берлин) за егонепосредственную поддержку при проведении кинетических исследований иобработке экспериментальных данных; доктору химических наук Д. И. Свергуну(Европейская лаборатория молекулярной биологии, Гамбург, Германия) запредоставление возможности проведения экспериментов МРР на разгонном кольцеDORIS немецкого электронного синхротрона и его непосредственное участие прианализеэкспериментальныхданных;проф.Г.Мею(G.Mei,Кафедраэкспериментальной медицины и биохимии университета Tor Vergata, Рим, Италия)за предоставленную возможность проведения экспериментов с использованиемдинамической флюоресценции и его непосредственному участию при анализеэкспериментальных данных; проф Е.
Скржыпчак-Янкун (E. Skrzypczak-Jankun,Толедо, США) за ценные советы в области МРР и критические замечания при191планировании и организации проведения эксперимента, а также проф. А. ГозалесЛафонт и ее научную группу (Институт биотехнологии и биомедицины Автономногоуниверситета г. Барселоны, Испания) за проведение теоретических исследований вобласти фермент-субстратных комплексов 12/15-липоксигеназы кролика.Особую благодарность автор выражает проф.
Миронову А.Ф., проф.Звонковой Е.Н. и проф. Маслову М.А. за особое внимание к языку и содержаниюавтореферата, а также всем членам кафедры химии и технологии биологическиактивных соединений им. Н.А. Преображенского (Институт тонких химическихтехнологий ФГБОУ ВО Московский технологический университет), которые взялина себя труд ознакомиться с данной работой и сделали ряд критическихзамечаний, улучшивших диссертацию.192СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИОбзоры:1.Kuhn H., Saam J., Eibach S., Holzhütter H.-G., Ivanov I., Walther M. Structural biologyof mammalian lipoxygenases: Enzymatic consequences of targeted alterations of theprotein structure // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005.
V. 338. P. 93-101.2.Ivanov I., Heydeck D., Hofheinz K., Roffeis J., O'Donnell V.B., Kuhn H., Walther M.Molecular enzymology of lipoxygenases // Arch. Biochem. Biophys. 2010. V. 503.P.161-74.3.ИвановИ.В,ГрозаН.В.,МягковаГ.И.,КюнХ.Структурнаябиологиялипоксигеназ: настоящее и перспективы развития // Вестник МИТХТ. 2014. T. 9.C. 3-26.4.Ivanov I., Kuhn H., Heydeck D. Molekular and structural biology of arachidonic acid15-Lipoxygenase (ALOX15) // Gene. 2015.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
